一种高产中性植酸酶的毕赤酵母突变菌的制作方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产中性植酸酶的毕赤酵母突变菌及其应用。


背景技术：

2.植酸是谷物类及粕类饲料中磷的主要存在形式，占总磷的60%-70%。在单胃动物（如人、猪和鸡和鱼类等）体内，因缺乏有效降解植酸的酶类，而导致对植酸磷的利用率极低，不被消化的植酸磷排出体外还会导致土壤和水资源污染；另一方面，植酸往往与蛋白类、糖类及钙、铁、锌等金属元素鳌合，不利于营养物质及矿物质的消化和吸收。因此，为了避免磷缺乏，饲料中往往还要额外添加无机磷，这就导致饲料成本的提高。
3.植酸酶是指能够水解植酸及其盐类物质中磷酸单酯键而生成低级磷酸肌醇和无机磷的一类酶的总称。根据植酸酶的序列、三维结构和催化机制，可以被分为四类，分别是：组氨酸酸性磷酸酶（histidine acid phosphatase，hap）、β-折叠桶磷酸酶（β-propeller phytase，bpp）、半胱氨酸磷酸酶 （cysteine phosphatase，cp）、紫色酸性磷酸酶（purple acid phosphatase，pap）。目前，植酸酶已经成为在单胃动物（如猪、鸡、鱼）饲料中应用最广的酶制剂之一，其在单胃动物日粮中的添加效果也已经得到了广泛的认同。植酸酶的作用场所主要是单胃动物的胃及肠道，对于鱼类而言，其消化道组成具有很大的多样性，并且相对较短，消化道的ph一般为6.5-7.5，接近中性，与猪和鸡酸性的消化道有很大区别。因此，水产饲料里的植酸酶要求在中性ph下具有较高的酶活性；另外由于鱼类养殖的水体温度一般在0-30℃之间，因此，投放到养鱼池的植酸酶需在低温环境中具有较高的活性。而在饲料上应用的植酸酶最适ph值主要是酸性的，只能在酸性条件下发挥水解植酸的能力，在ph高于6.0时，酶活性损失严重。因此，开发中性低温植酸酶在水产养殖中具有较大的应用潜力和商业价值。
4.中性植酸酶主要指bpp植酸酶，主要来源于芽孢杆菌属。芽孢杆菌来源的β-propeller中性植酸酶都具有相似的酶学性质，其最适ph范围都在6.0-8.0之间，具有相近的分子量和酶促反应最适ph，其催化活性、热稳定性及ph稳定性均依赖于ca
2+
。但是目前已知bpp类植酸酶的最大缺点是催化效率低和生产成本高，很难满足实际生产需求。所以获得新型优质bpp植酸酶，提高bpp类植酸酶的产量，是目前急需解决的问题和热点。


技术实现要素：

5.本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产中性植酸酶的毕赤酵母突变菌及其应用。申请人首先将中性植酸酶基因转入毕赤酵母（pichia pastoris）宿主中，构建得到重组表达该酶的工程菌株；然后通过紫外诱变筛选获得中性植酸酶产量得到显著提高的突变菌，从而大幅度降低该酶的生产成本，促进其在水产饲料领域中的广泛应用。
6.本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有表达中性植酸酶基因的重组表达载体。
7.所述中性植酸酶基因的核苷酸序列为seq id no：1，编码的氨基酸序列为seq id no：2。
8.本发明另一方面涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
9.所述突变菌株为毕赤酵母zz-2-54（pichia pastoris zz-2-54），已于2022年7月20日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20221138。
10.本发明还涉及上述毕赤酵母菌株在中性植酸酶生产中的应用。
11.与出发菌相比，本发明提供的毕赤酵母突变菌株能大幅度提高中性植酸酶的产量，其摇瓶发酵上清液中中性植酸酶酶活高达12247u/ml，比出发菌提高了89%，取得了意料不到的技术效果。
12.所述突变菌株可广泛应用于中性植酸酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在水产饲料领域中的推广与应用。
具体实施方式
13.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning: a laboratory manual, 3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
14.菌株与载体：大肠杆菌dh5α本公司保藏，毕赤酵母gs115、载体ppic9k、g418购自invitrogen公司。
15.试剂和培养基：dna聚合酶购买自takara公司，t4连接酶、限制性内切酶购自fermentas公司，分子试剂盒购自omega公司，其他生化试剂均为国产分析纯试剂。
16.主要培养基：lb培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，ph7.0；ypd培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；md培养基：1.34% ynb，4
×
10-5
生物素，1%甘油、2%琼脂糖；bmgy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
%生物素，1%甘油；bmmy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
%生物素，0.5%甲醇。
17.氨苄青霉素（amp）：储存浓度为100mg/ml，工作浓度为100mg/l；抗生素用ddh2o溶解，滤膜（0.22μm）过滤后，-20度保存。
18.遗传霉素g418：用ddh2o制备30ml遗传霉素（100mg/ml）储存液，过滤除菌，-20度保存。
19.下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。
20.实施例1、中性植酸酶基因克隆
将来源于萎缩芽孢杆菌（bacillus atrophaeus）的中性植酸酶基因（genbank号为wp_094232213.1）命名为zz-2。分析中性植酸酶zz-2的氨基酸序列，去除其自身的信号肽，再根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化，由华大基因公司进行全基因合成。中性植酸酶zz-2的核苷酸序列为seq id no：1，编码的氨基酸序列为seq id no：2。
21.采用pcr反应克隆中性植酸酶zz-2基因片段，引物和反应条件如下：上游引物1(f)：gcgcgaattcgctccattggctgctaaacaagttc（下划线处为ecor i酶切位点）；下游引物1(r)：taaagcggccgcttaagtaccagatctatctttcaat（下划线处为not i酶切位点）。
22.pcr条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min20s，35个循环后，72℃保温10min。zz-2基因全长1089bp。
23.实施例2、重组表达中性植酸酶的毕赤酵母工程菌的构建1、表达载体的构建将克隆得到的中性植酸酶zz-2基因，用限制性内切酶ecor i和not i进行双酶切，100 μl酶切体系如下：反应组分体积zz-2的pcr产物40μl10
×
hbuffer10μl10
×
bsa10μlecori5μlnoti5μlddh2o30μl37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
24.将表达载体ppic9k先用限制性内切酶ecor i和not i进行双酶切，100 μl酶切体系如下：反应组分体积ppic9k40μl
10
×
hbuffer10μl10
×
bsa10μlecori5μlnoti5μlddh2o30μl37℃酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
25.将经ecori和noti双酶切的zz-2片段与表达载体ppic9k连接，构建表达载体ppic9k-zz-2。连接体系如下：反应组分体积ppic9k双酶切产物5μlzz-2基因双酶切产物3μl10
×
t4ligasebuffer1μlt4ligase1μl22℃连接过夜，转化到大肠杆菌dh5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到lb+amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组表达载体ppic9k-zz-2。
26.2、转化与筛选将重组表达载体ppic9k-zz-2用sali进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母gs115，涂布md平板。在md平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素g418的ypd平板上筛选多拷贝的转化子。
27.3、摇瓶发酵验证挑取单个多拷贝转化子分别接入bmgy培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入bmmy培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24h添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行中性植酸酶酶活力测定。
28.结果显示，在摇瓶条件下，上述构建得到的毕赤酵母工程菌发酵上清液中中性植酸酶酶活最高达到6480u/ml。将酶活水平最高的转化子命名为毕赤酵母zz-2（pichiapastoriszz-2）。
29.中性植酸酶酶活检测方法1、酶活力定义在温度为25℃、ph为6.5的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/l植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以u表示。
30.2、原理植酸酶在一定温度和ph条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能与钒钼酸铵处理会生成黄色的[(nh4)3po4nh4vo3·
16moo3]复合物，在波长415nm下进行比色测定。
[0031]
3试剂与材料本标准中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。清洗试验用容器要用不含磷的清洗剂。
[0032]
3.10.25mol/l乙酸缓冲液(ⅰ)称取34.02g三水乙酸钠(ch3coona
·
3h2o)于1000ml烧杯中，加入900ml水,用玻璃
棒搅拌至完全溶解，用冰乙酸酸调节ph至6.50
±
0.01，并用去离子水定容至1000ml，室温下存放一个月有效，放置2周以上需要重新校准ph。
[0033]
3.20.25mol/l乙酸缓冲液(ⅱ)称取34.02g三水乙酸钠(ch3coona
·
3h2o)、0.5gtritonx-100和0.5g牛血清白蛋白(bsa)于1000ml烧杯中，加入900ml水，用玻璃棒搅拌至完全溶解，用冰乙酸酸调节ph至6.50
±
0.01，并用去离子水定容至1000ml，室温下存放一个月有效，放置2周以上需要重新校准ph。
[0034]
3.37.5mmol/l植酸钠溶液用玻璃烧杯配制，称取0.6929g肌醇六磷酸钠(c6h6o
24
p6na
12
，分子量923.8)于100ml烧杯中，加入80ml乙酸缓冲液ⅰ，用洁净的玻璃棒间隔性持续搅拌直至溶解，然后用冰乙酸调节ph至6.50，转移至100ml容量瓶中，用缓冲液ⅰ定容至100ml，现用现配。
[0035]
3.4硝酸溶液：1＋2水溶液。
[0036]
3.5100g/l钼酸铵溶液称取10g钼酸铵于100ml烧杯中，加入约80ml水，用玻璃棒搅拌至完全溶解，然后加入1ml氨水(25%)并混合均匀，转移至100ml容量瓶，用去离子水定容至刻度，混合均匀。
[0037]
3.62.35g/l钒酸铵溶液在分析天平上准确称取钒酸铵0.235g备用，取100ml烧杯加入50ml去离子水，电炉上加热至沸腾，沸腾后将沸水从电炉上取下，放在实验台上，立即加入已准备好的钒酸铵粉末，玻璃棒搅拌至完全溶解，然后立即加入40ml去离子水，搅拌均匀并冷却至室温，然后加入2ml硝酸溶液，混合均匀，去离子水定容至100ml，转移至棕色试剂瓶中存放。
[0038]
注意事项：避光室温保存，1周内使用有效。
[0039]
3.7酶解反应终止及及显色液取2份硝酸溶液、1份钼酸铵溶液、1份钒酸铵溶液，混合均匀后使用，现用现配。
[0040]
3.8磷酸二氢钾(kh2po4)：基准物。
[0041]
4、标准曲线准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液ⅰ溶解，并定容至100ml，浓度为50.0mmol/l。按表1的比例用乙酸缓冲液ⅰ稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y=ax＋b)。
[0042]
表1标准稀释比例标准溶液序号稀释量/ml浓度/(μmol/l)10.5
→
125.00020.5
→
212.50030.5
→
46.250040.5
→
83.125050.5
→
161.56255、反应酶液准备5.1固体样品
准确称取1g酶制剂样品(精确至0.0001g)于100ml三角瓶中，加入50ml乙酸-乙酸钠缓冲液ⅱ，磁力搅拌30min，4000rpm离心10min，取上清即为浸提酶液。用乙酸-乙酸钠缓冲液ⅱ稀释至约0.4u/ml，控制最终比色的吸光值在0.4~0.6范围内。
[0043]
5.2包衣固体样品取3~5g包衣固体酶制剂样品于合适大小的研钵中，碾碎、研磨至包衣破碎。然后同普通固体样品相同操作。
[0044]
用乙酸-乙酸钠缓冲液ⅱ稀释至约0.4u/ml，控制最终比色的吸光值在0.4~0.6范围内。
[0045]
6、反应取4支18*180mm试管(1支作为空白、另外3支作为平行)按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支试管中加入的时间间隔要绝对一致。
[0046]
反应步骤及试剂、溶液用量见表2。
[0047]
表2反应步骤及试剂、溶液用量反应顺序样品、标准品样品空白1.加乙酸缓冲液(5.1)1.8ml1.8ml2.加待反应酶液0.2ml0.2ml3.混合∨∨4.25℃预热5min∨∨5.依次加入底物溶液(5.3)4ml(第一步)4ml(第二步)6.混合∨∨7.25℃水浴中酶解30min∨∨8.依次加入终止液(5.7)4ml(第二步)4ml(第一步)9.混合∨∨总体积10ml10ml7、样品的测定反应后的试样在室温静置10min显色，若出现浑浊需要在离心机上以4000r/min离心10min，以空气调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白(a0)和样品溶液(a)的吸光值，a-a0为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。
[0048]
8、结果计算u=f
×
c/(m
×
30)。
[0049]
式中：u—试样中植酸酶的活性，u/ml（或u/g）；c—根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的无机磷的量，单位为μmol；f—试样溶液反应前的总稀释倍数；m—试样质量，g；30—反应时间，min。
[0050]
9、重复性同一样品两个平行测定值的相对偏差，植酸酶产品不大于5%。
[0051]
实施例3、植酸酶高产菌株的紫外诱变筛选
诱变育种的基本原理是基因突变，主要包括染色体畸变和基因突变。诱变育种是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。
[0052]
紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。
[0053]
申请人以毕赤酵母zz-2为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高中性植酸酶的产量。
[0054]
将出发菌毕赤酵母zz-2接种于ypd平板，30℃培养2-3天，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1
×
106个/ml，紫外灯（40w）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板，30℃培养48h。
[0055]
第一轮紫外诱变共获得了约200个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有200ul bmgy液体培养基的96孔板，30℃、250rpm振荡培养1天后，离心去掉上层培养基，再加入200ul bmmy培养基，30℃、250rpm振荡培养2天，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2天后，离心去除菌体，得到含中性植酸酶的上清液，测定中性植酸酶的活力，以出发菌为对照，筛选出酶活力得到显著提高的突变菌株。
[0056]
结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中中性植酸酶酶活高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了21轮诱变筛选，最终获得1株中性植酸酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名毕赤酵母zz-2-54（pichia pastoris zz-2-54）。
[0057]
所述突变菌株在摇瓶条件下发酵，其发酵上清液中中性植酸酶酶活力高达12247u/ml，比出发菌提高了89%，取得了意料不到的技术效果。
[0058]
申请人已于2022年7月13日将毕赤酵母zz-2-54（pichia pastoriszz-2-54）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20221138。