活性肽及间充质干细胞在促进脐带造血干细胞增殖中的应用的制作方法

1.本技术涉及生物领域，更具体的涉及多肽领域，涉及活性肽及间充质干细胞在促进脐带造血干细胞增殖中的应用。


背景技术：

2.脐带血中含有大量的干细胞，包括造血干细胞和多种其他干细胞，统称为脐带血干细胞。脐带血造血干细胞已经有30多年拯救生命的历史。脐带血干细胞的临床治疗已有30余年的历史。目前，全世界已经进行了40000余例脐带血造血干细胞移植，来源包括公共库和家庭库的脐带血。已经有80多种严重疾病可以用脐带血干细胞进行治疗，多项在再生医学方面的临床试验正在开展。脐带血移植面临的主要问题是ucb-hscs数量不足。增加hscs数量或者在干细胞的数量不变的情况下增加其归巢的比例是目前研究热点。由于脐带血本身数量并不是特别多，因此，体外扩增脐带血干细胞是目前主要的研究方向。
3.目前脐带血hspcs体外扩增实验也进行了几种优化扩增条件的尝试，包括使用多种特定培养基、细胞因子组合、小分子化合物使用、相关信号通路的调控和表观遗传学调控等，目前利用细胞因子扩增技术仍是最重要的工具，几乎所有成熟的扩增体系中均有细胞因子的参与。mscs是发育早期中胚层内一种具有多向分化能力的干细胞，存在于全身结缔组织和器官间质中，如骨髓、脐带、胎盘和脂肪组织等。在20世纪60年代首次在实验中分离mscs，其具有多向分化潜能、支持造血和促进hscs植入、调节免疫等特点。来自羊膜、绒毛膜、脐带华通氏胶、羊水、脐带血及骨髓的mscs与hpscs共培养，均可以使hspcs扩增。其中人骨髓来源(hbm-mscs)和人脐带来源的mscs(huc-mscs)促进hscs增殖的研究较多。
4.研究表明，mscs能够促进造血干细胞中的notch和wnt信号通路，而notch和wnt信号是高度保守的细胞间通讯通路，参与造血等发育过程。mscs表达和分泌包括notch和wnt生物活性分子，notch和wnt信号通路的激活对hscs的维持、自我更新、增殖和分化所有阶段至关重要。uc-mscs及cd34+细胞表面存在notch信号配体及受体的表达，当它们共培养时notch通路相关信号分子jagged1和notch1基因表达明显增加，说明notch信号在mscs支持的ucb-hscs增殖过程中发挥重要作用。另外，mscs的notch和wnt通路激活还参与介导hscs的黏附和迁移，促进hscs归巢。acuto等[27]研究显示通过模拟造血生态位的直接细胞接触培养系统，uc-mscs可以支持ucb-hscs扩增。发现在wnt信号通路中，主要是wnt蛋白具有增殖-诱导生长因子的作用，它可以决定细胞的命运。但是与bm-mscs相比，uc-mscs的造血支持能力未显示出优势，可能是由于uc-mscs对成骨细胞和脂肪细胞的谱系启动和分化能力较弱，这与wnt信号相关分子wisp1和sfrp4在uc-mscs表达较低有关。
[0005]
mscs作为“饲养层”与脐带血干细胞共培养可以提高cd34+细胞的干细胞数量并维持其干性。研究发现mscs结合或者不结合造血刺激因子均能够提高扩增效率以增加cd34+细胞的数量。使用huc-mscs作为饲养层，使用无血清培养系统和细胞因子，进行脐带血来源的cd34+细胞体外扩增，tnc增加6-20倍，cd34+细胞增加8-37倍。在具有添加scf、flt-3、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子和mscs饲养层存在下扩增
ucb-hscs，与无mscs饲养层而具有细胞因子的培养条件相比，仅flt-3与mscs共培养就可以使cd34+达到20倍的扩增。通过与huc-mscs直接接触培养、transwell系统分离培养或在huc-mscs条件培养基存在的情况下，也发现在短期内可以显著扩增脐带血来源的cd34+的hspcs。
[0006]
当然，除了干细胞之外，还有一些蛋白和多肽也能够促进造血干细胞的增殖。比如，现有技术公开了色素上皮衍生因子衍生的多肽对于促进干细胞增殖与伤口愈合的用途,此合成多肽可用以促进干细胞生长或伤口愈合。也研究表明高迁移率族蛋白b1是一种dna结合蛋白，对cd34+的人脐带血造血干细胞具有趋化作用，能够促进cd34+的人脐带血造血干细胞的增殖作用。
[0007]
但是目前，针对人脐带造血干细胞增殖的研究还有待进一步的提高，高效的促增殖的方法还有待进一步的丰富和完善。


技术实现要素：

[0008]
本发明基于现有技术的缺陷，提供了一种改进的用于促进脐带血干细胞增殖的方法及相应的用途，
[0009]
进一步的，本发明发明人前期通过自己构建的多肽筛选文库，通过建模和高通量的筛选，以sdf-1以及增殖因子作为重要筛选靶标，制备获得了能够促进脐血造血干细胞增殖的活性肽3个。其中本技术涉及hsc-c1。所述多肽主要促进细胞中sdf-1基因的表达，协同促进细胞中细胞因子的分泌，进而促进细胞的增殖作用。
[0010]
进一步的，本发明的活性肽为hsc-c1，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0011]
进一步的，在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在90％以上。
[0012]
进一步的，在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在85％以上。
[0013]
进一步的，在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在80％以上。
[0014]
进一步的，在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在75％以上。
[0015]
进一步的，在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在70％以上。
[0016]
进一步的，本发明提供了一种促进脐带造血干细胞增殖的方法，所述方法包括：
[0017]
取transwell用于共培养，将脐带间充质干细胞hucmsc接种于下室，脐带血cd34+造血干细胞hsc接种于上室，在il-3 10ng/ml、scf 10ng/ml、imdm 89％+胎牛血清10％+青-链霉素1％的培养液中培养7d；其中hsc 1
×
104/孔；hucmsc 1
×
105/孔；hsc-c1多肽100μg/ml。
[0018]
进一步的，本发明提供了hsc-c1活性肽在制备促进脐带血造血干细胞增殖的药物或培养基中的用途，其中，活性肽hsc-c1的氨基酸序列如seq id no：1所示。进一步的，在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在90％以上。进一步的，在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在85％以上。进一步的，
在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在80％以上。进一步的，在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在75％以上。进一步的，在保留hsc-c1的活性基础，采用保守的氨基酸替换，并且同源性保持在70％以上。
[0019]
进一步的，本发明的脐带血造血干细胞为商业购买即可。
[0020]
更进一步的，本发明的脐带血造血干细胞为通过本领域常规的造血干细胞分离方法制备获得。
[0021]
更进一步的，具体的脐带血造血干细胞的分离方法，包括以下步骤：
[0022]
(1)将6％羟乙基淀粉(hes)分别加入每份脐带血内(hes的加入量为血量的1/4),混匀,在10℃低温环境中倒置6小时分层。(2)缓慢放出袋内脐血的下层红细胞,置于50ml离心管中,上层血浆放入另一50ml离心管内。(3)将收集的红细胞以600r/min离心5min,将上层血浆部分吸出与步骤(2)中的血浆混合,将红细胞弃去。(4)将收集的血浆以600r/min离心5min,将上清部分保留在50ml离心管中,弃去下层红细胞。(5)将收集的上清以1200r/min离心10min,取上层上清1ml备用,其余上清弃去,将含有核细胞下层部分浓缩至约5ml,用pbs将其体积调整至25ml。(6)重复步骤(5)三次后,最终所得细胞以pbs调整体积至5ml。(7)将所得有核细胞液按1:1比例加入氯化铵破红细胞液(nh4cl)5ml,混匀,800r/min离心10min,弃去上清部分,将所得下层细胞以pbs反复洗涤3次,重悬于上述(5)1ml备用上清中,调整其体积至1000μl。应用minimacs cd34+用细胞免疫磁珠分选系统富集cd34+细胞，即获得了脐带血cd34+造血干细胞。
[0023]
更进一步的，本发明的脐带间充质干细胞可以是商业购买获得。
[0024]
更进一步的，本发明的脐带间充质干细胞也可以通过本领域常规的分离制备方法，制备获得。
[0025]
更具体的，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：脐带组织消毒，剪成2cm小段，剥去血管及外皮，分离出华通氏胶组织。将组织剪成2～3mm小块，每小块重悬在10ml20％胎牛血清的dmem/f12培养基中，接种至t75培养瓶，置37℃，5％co2饱和湿度培养箱中培养。待细胞汇合度达70％时，收集培养瓶中组织块，转接种至新的t75培养瓶，进行二次贴壁。每3～4d换液1次，待细胞汇合度达85％时，经胰酶消化收集细胞即为脐带间充质干细胞。
[0026]
本文提供的含有hsc的细胞群体赋予了在脐带血中发现的干细胞的相同或相似的优点。本领域技术人员将容易认识到来自脐带血的干细胞的特征以及其中的有利特性。在一些实施方案中，本文提供的含有hsc的细胞群体的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％是扩增的hsc细胞。
[0027]
本文提供了扩增的造血干细胞(hsc)的细胞培养物、用于维持和/或增强在培养物中的造血干细胞的扩增的细胞培养基、和含有hsc的细胞群体。此类含有hsc的细胞群体可以通过本文描述的方法来制造。造血干细胞可以包括哺乳动物和禽类的造血干细胞。造血细胞群体可能具有体内治疗性应用的潜力。所述培养基包含基础培养基或补料培养基以及本发明的多肽。用于培养哺乳动物细胞的任何合适的基础培养基或补料培养基可以用于本发明的上下文，并且可以包括但不限于可商购培养基，诸如dmem培养基、imdm培养基、stemspan无血清扩增培养基(sfem)、199/109培养基、ham的f10/f12培养基、mccoy的5a培养基、αmem培养基(不含酚红以及含酚红)、和rpmi1640培养基。在一些实施方案中，所述基础
培养基或补料培养基是α-mem培养基(不含酚红)。
[0028]
进一步的，本发明制备的扩增的hsc细胞用于治疗血液系统非恶性肿瘤例如可以为再生障碍性贫血、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无巨核细胞性血小板减少症或其它血液系统非恶性肿瘤。
[0029]
本发明的治疗给药是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将含有hsc细胞的药物组合物物理引入个体。根据本发明，含有hsc细胞的的组合物可以通过任何达到其预期目的的方法给药。根据本发明的一个实施方案，含有hsc细胞的的组合物可以作为输液给药。例如，给药可以是静脉内，肌肉内，腹膜内，皮下或其它胃肠外给药途径，例如通过注射或输注疗法。除了药理学活性化合物之外，所述药物组合物还包含合适的药学上可接受的载体，所述载体包含有助于将所述活性化合物加工成可药用制剂的赋形剂和助剂。根据本发明，在本发明的一个实施方案中，还可以添加其他的能够促进生血的第二药物。
[0030]
有益效果
[0031]
本发明提供了一种活性多肽，该多肽能够促进脐带造血干细胞的增殖。还提供了一种改进的促进脐带造血干细胞增殖的方法，所述方法通过将脐带间充质干细胞与脐带造血干细胞和活性多肽混合培养后能够显著的提高造血干细胞增殖的效果，而且制备的造血干细胞通过活性验证表明具有较好的治疗效果。
附图说明
[0032]
图1多肽对造血干细胞增殖效果图
[0033]
图2qrt-pcr法检测多肽对hsc的sdf-1基因表达量的影响结果图
[0034]
图3多肽联合脐带间充质干细胞促进造血干细胞增殖的效果图
[0035]
图4ki67和ang1的基因表达量结果图
[0036]
图5各组血小板数量结果图
具体实施方式
[0037]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0038]
实施例1脐带血造血干细胞的制备
[0039]
(1)将6％羟乙基淀粉(hes)分别加入每份脐带血内(hes的加入量为血量的1/4),混匀,在10℃低温环境中倒置6小时分层。
[0040]
(2)缓慢放出袋内脐血的下层红细胞,置于50ml离心管中,上层血浆放入另一50ml离心管内。
[0041]
(3)将收集的红细胞以600r/min离心5min,将上层血浆部分吸出与步骤(2)中的血浆混合,将红细胞弃去。
[0042]
(4)将收集的血浆以600r/min离心5min,将上清部分保留在50ml离心管中,弃去下层红细胞。
[0043]
(5)将收集的上清以1200r/min离心10min,取上层上清1ml备用,其余上清弃去,将含有核细胞下层部分浓缩至约5ml,用pbs将其体积调整至25ml。
[0044]
(6)重复步骤(5)三次后,最终所得细胞以pbs调整体积至5ml。
[0045]
(7)将所得有核细胞液按1:1比例加入氯化铵破红细胞液(nh4cl)5ml,混匀,800r/min离心10min,弃去上清部分,将所得下层细胞以pbs反复洗涤3次,重悬于上述(5)1ml备用上清中,调整其体积至1000μl。
[0046]
应用minimacs cd34+用细胞免疫磁珠分选系统富集cd34+细胞，结果显示，分离制备的有cd34+细胞数为(3.64
±
0.26)
×
106。
[0047]
实施例2hsc-c1多肽对造血干细胞增殖的影响
[0048]
经分离得到的cd34+细胞，按1
×
104/ml细胞密度接种到96孔细胞培养板中。培养体系为含10％fbs(gibco公司产品)，100u/ml青霉素、100ml链霉素的rpmi1640培养液。对照组脐血cd34+细胞自身的培养，实验组为cd34+细胞与hsc-c1多肽的共培养，hsc-c1多肽终浓度为1、10、50、100μg/ml，对照组和实验组均加入50ng/ml scf、5ng/ml il-3和2u/ml epo，终体积均为200μl。每组设3个平行孔，置于37℃、5％co2、饱和湿度下培养7d。结果如图1所示。
[0049]
从图1的结果显示，多肽与造血干细胞共培养7d后，各组hsc细胞数均得到显著增加，与没有添加多肽的对照组相比，差异显著(p《o.05)。在hsc-c1多肽终浓度为100μg/ml条件下，cd34+细胞密度达到(24.56
±
1.32)
×
104/ml，比对照组的(13.42
±
1.07)
×
104/ml有显著的提高。
[0050]
荧光定量qrt-pcr法检测上述各组中hsc的sdf-1基因的表达情况。sdf-1上游引物：gcctgagctacagatgcc，agctttctccaggtactcct；β-actin上游引物agagatggccacggctgctt，下游引物atttgcggtggacgtggag；pcr反应条件为94℃预变性1min；然后94℃变性35s，57℃退火40s，72℃延伸35s，共30个循环；最后72℃延伸1min。结果如图2所示。
[0051]
从图2的结果可以看出，本发明提供的hsc-c1多肽能够显著的促进sdf-1基因的高表达，在hsc-c1的终浓度为100μg/ml条件下，基因相对表达量达到(3.69
±
0.06)。
[0052]
实施例3脐带间充质干细胞的制备
[0053]
脐带组织消毒，剪成2cm小段，剥去血管及外皮，分离出华通氏胶组织。将组织剪成2～3mm小块，每小块重悬在10ml20％胎牛血清的dmem/f12培养基中，接种至t75培养瓶，置37℃，5％co2饱和湿度培养箱中培养。待细胞汇合度达70％时，收集培养瓶中组织块，转接种至新的t75培养瓶，进行二次贴壁。每3～4d换液1次，待细胞汇合度达85％时，经胰酶消化收集细胞。取10ul细胞，将p1细胞制成密度为1
×
105个/ml的单细胞悬液，用pbs洗涤后，分别加入抗体cd73-pe、cd105-pe、cd34-pe、cd79a-pe，cd45-fitc、cd14-fitc、hla-dr-fitc、cd90-fitc，4℃避光孵育30min；pbs洗涤后，上流式细胞仪检测。结果如下表1所示。
[0054]
表1细胞的免疫表型
[0055]
表型鉴定结果(％，x
±
s，n＝3)cd140.66
±
0.03hla-dr0.58
±
0.04cd450.62
±
0.02
cd79a0.38
±
0.05cd340.89
±
0.10cd9099.12
±
0.24cd7399.53
±
0.16cd10599.69
±
0.11
[0056]
从表1的结果可以看出，分离制备的脐带间充质干细胞hucmsc低表达cd34、cd45、cd14、cd79a、hla-dr，高表达cd73、cd90、cd105，复合干细胞的特性，证实分离制备并获得了脐带间充质干细胞。
[0057]
实施例4hsc-c1多肽联合脐带间充质干细胞在促进脐带血造血干细胞增殖中的作用
[0058]
取transwell用于共培养，将脐带间充质干细胞hucmsc接种于下室，脐带血cd34+造血干细胞hsc接种于上室，在il-3 10ng/ml、scf 10ng/ml、imdm 89％+胎牛血清10％+青-链霉素1％的培养液中培养7d。设置分为hucmsc+hsc、hucmsc+hsc+hsc-c1多肽、单独培养hsc、hsc+hsc-c1多肽组共4组。每组设3个复孔，其中hsc 1
×
104/孔；hucmsc 1
×
105/孔；hsc-c1多肽100μg/ml(图3)。
[0059]
从图3的结果显示，在transwell小室内，将脐带间充质干细胞hucmsc接种于下室，脐带血cd34+造血干细胞hsc接种于上室，通过7d培养后，可以显著的看到相对于没有添加脐带间充质干细胞的培养体系，添加了脐带间充质干细胞的培养体系中hsc的细胞数量得到显著的提高(p《0.05)。同时在添加了hsc-c1多肽的作用后，能够更加进一步的提高了hsc的细胞数量，达到了(142.63
±
9.53)
×
104/ml。
[0060]
荧光定量qrt-pcr法检测上述各组中hsc的增殖基因ki67和ang1的表达情况。ki-67上游引物caagccacagtccaagagaa，下游引物gtgtccatagctttccctactg；β-actin上游引物agagatggccacggctgctt，下游引物atttgcggtggacgtggag；ang1上游引物ggaaatccctccggtgaata，下游引物gttcccttcccagtccatta。pcr反应条件。结果如图4所示。
[0061]
从图4的结果可以看出，相较于单独培养的hsc，采用hucmsc+hsc+hsc-c1多肽共培养7d后的hsc的增殖基因ki67和ang1的表达量得到显著的提高(p《0.05)。增殖基因ki67和血管生成因子ang1的mrna的表达与hsc单独培养组比较，相对表达量分别达到了(37.95
±
1.02)和(6.01
±
0.79)，提高较为显著。
[0062]
实施例5脐带造血干细胞的活性验证
[0063]
取雄性nod/scid小鼠，spf级，鼠龄8周，饲养于无菌环境，无菌饮食、饮水。移植前4h将小鼠置于无菌透气的纸盒中，外罩消毒巾，
137
cs照射3.ogy。之后随机分为3组：(1)单移植组：经尾静脉输注1
×
1o5个实施例1制备的cd34+细胞；(2)共移植组：经尾静脉缓慢输注1
×
1o5个cd34+细胞和实施例3制备的1
×
1o6个hucmsc；(3)多肽协同共移植组：经尾静脉缓慢输注1
×
1o5个cd34+细胞和实施例3制备的1
×
1o6个hucmsc以及hsc-c1多肽100μg/ml；(4)空白对照组：照射后不作细胞移植。移植后的第6周，抽取血液，进行外周血检测。
[0064]
通过外周血检测发现，移植后第3周起两组小鼠外周血项开始恢复，其中白细胞、血小板恢复时间较快，移植后6周时第(2)组和第(3)组白细胞、血小板计数得到显著的恢复，且明显高于第(1)组。并且，从图5的结果可以看出，针对血小板的含量，hsc-c1多肽协同共移植组治疗后，血小板的量达到了(16.82
±
0.56)
×
1o
11
个，比共移植组的(14.26
±
0.63)
×
1o
11
个也有显著的提高，更比单移植组的效果要好。此外，空白对照组小鼠均于照射后2-3周死亡，而治疗组的小鼠在6周时均健康存活。从以上结果也可以看出，本发明制备的共移植治疗剂也就有较好的安全性。
[0065]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。