一种延缓MSCs衰老的方法

一种延缓mscs衰老的方法
技术领域
1.本发明涉及延缓衰老技术领域，具体是一种延缓mscs衰老的方法。


背景技术：

2.随着社会的进步和经济的快速发展，人口老龄化将成为全世界主要的社会经济问题，而衰老是其发生的最重要原因之一。衰老是一个复杂的过程，表现为生理活动下降、低能量代谢水平、应激反应诱导的体内平衡丧失，从而导致疾病和死亡的风险增加。目前，科学界已经提出300多种理论或假说来解释衰老的发生、发展及机制，其中干细胞衰老理论是目前生物体衰老机制中的最新理论之一。干细胞衰老理论认为成体干细胞衰老是组织器官衰老、个体衰老以及各种老龄化疾病发生的重要原因，干细胞是研究衰老机制极其重要的模型。因此，激活衰老的干细胞是延缓个体衰老、预防神经退行性疾病、代谢性疾病和各种恶性肿瘤等衰老相关疾病的有效措施，能够最大限度地提升老龄人口的生命质量。衰老与代谢失调密切相关，代谢失调是衰老的关键标志。与衰老相关的代谢途径，如mtor和ampk途径，雷帕霉素、二甲双胍和运动等能够直接或间接调控该途径，已成为抗衰老干预的主要靶点。随着年龄的增长，膜磷脂的不饱和程度也增加，脂质过氧化产物增多可能导致细胞损伤。此外，不同类型的饮食干预可以影响衰老，而这些干预往往伴随着脂质稳态的改变。膳食脂类通过影响成体干细胞活性，调控脂质代谢相关基因的表达，增强脂质分解能力，有助于实现健康衰老。脂质能够通过影响能量储存、质膜组成、信号转导和基因表达变化来调节干细胞的生物学特性。然而，脂质代谢变化如何影响干细胞衰老至今仍未被探索。
3.成体干细胞是存在于成体体内分化组织中的未分化细胞，其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一类具有高效自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。它们易于体外培养，能够与宿主细胞接触，并具有免疫耐受性，是组织工程和治疗各种疾病的理想种子细胞。然而，在体外扩增培养过程中，mscs脂质合成能力降低，mscs出现衰老的特征性表型，如形态变化、增殖活性降低和生理功能失衡。因此，无法通过体外扩增获得足够数量的mscs以满足临床治疗的需求。干细胞的衰老严重限制其临床应用，如患者自体干细胞移植，组织、器官再生和修复等。
4.mscs是许多疾病细胞治疗的基础，是一种研究较早且深入的成体干细胞，已经成为干细胞组织工程学的主要种子细胞。正常的骨髓样本获取困难，无法获得充足的特定年龄阶段的骨髓mscs，且mscs随着体外培养次数增加，其增殖活性和多向分化潜能降低，细胞发生衰老。干细胞衰老极大制约了干细胞的临床应用，降低了患者自体干细胞移植的疗效。因此，针对以上现状，迫切需要提供一种延缓mscs衰老的方法，以克服当前实际应用中的不足。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种延缓mscs衰老的方法，旨在解决上述技术背景中的问题。
6.本发明是这样实现的，一种延缓mscs衰老的方法，该方法包括如下步骤：
7.步骤1：获取衰老的mscs；
8.步骤2：利用携带scd2的慢病毒感染衰老的mscs，使得衰老的mscs的脂质合成水平上调，进而延缓mscs衰老。
9.作为本发明进一步的方案：在步骤1中，获取衰老的mscs的具体步骤为：
10.步骤1.1：从大鼠骨髓中提取原代细胞，利用全骨髓贴壁法及体外传代培养，获得早代次mscs(epmscs，p2-p3)及晚代次mscs(lpmscs，p9-p10)；
11.步骤1.2：通过形态学观察(细胞形态学特点、细胞表面积和长宽比)、衰老相关β半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色以及衰老相关因子p16
ink4a
的表达，建立复制性衰老的mscs。
12.作为本发明进一步的方案：在步骤1.1中，所述大鼠为1-2月龄雄性wistar大鼠。
13.作为本发明进一步的方案：在步骤2中，携带scd2的慢病毒感染衰老mscs的时间为48h-72h。
14.作为本发明进一步的方案：所述方法在制备延缓衰老的药品中的应用。
15.作为本发明进一步的方案：所述方法在制备抗皮肤衰老保健品中的应用。
16.作为本发明进一步的方案：所述方法在制备食品添加剂中的应用。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果：
18.本发明围绕scd2影响mscs脂质合成水平调控细胞衰老进行探讨，首次将scd2与mscs衰老有机联系，从干细胞脂质代谢这一新颖角度去探究干细胞衰老，发现scd2能够通过提高细胞脂质合成水平来延缓间充质干细胞衰老，为阐明干细胞衰老的调控机制提供实验依据，也为体外培养获得大量年轻态mscs提供了新思路和新技术，将有助于维持干细胞数量及功能，有助于延缓机体衰老及防治各种老龄化疾病，对社会长久健康发展具有重要意义。
附图说明
19.图1a为本发明实施例1中显微镜下显示的epmscs及lpmscs细胞形态；
20.图1b为本发明实施例1中epmscs及lpmscs细胞形态的参数分析结构；
21.图1c为本发明实施例1中sa-β-gal染色结果；
22.图1d为本发明实施例1中利用rt-qpcr技术检测衰老相关因子p16
ink4a
mrna水平的结果示意图；
23.图2a为本发明实施例2中lpmscs和epmscs经茜素红染色后的对照图；
24.图2b为本发明实施例2中western blot结果示意图；
25.图2c为本发明实施例2中epmscs和lpmsc的红色荧光强度对照示意图；
26.图2d为本发明实施例2中rt-qpcr检测epmscs与lpmscs中scd2 mrna表达水平示意图；
27.图2e为本发明实施例2中western blot检测epmscs与lpmscs中scd2蛋白表达水平示意图；
28.图3a为本发明实施例3中显示scd2慢病毒过表达后，各组mscs均表达绿色荧光蛋白示意图；
29.图3b为本发明实施例3中rt-qpcr检测结果示意图；
30.图3c为本发明实施例3中western blot检测结果示意图；
31.图4a为本发明实施例4中sa-β-gal染色检测细胞衰老情况示意图；
32.图4b为本发明实施例4中rt-qpcr检测衰老相关因子的表达图；
33.图4c为本发明实施例4中茜素红染色检测细胞成骨分化能力示意图；
34.图4d为本发明实施例4中western blot检测细胞成骨分化能力示意图；
35.图4e为本发明实施例4中尼罗红染色检测过表达scd2对细胞脂质合成水平的影响示意图。
具体实施方式
36.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
37.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
38.本发明实施例提供的一种延缓mscs衰老的方法，该方法包括如下步骤：
39.步骤1：获取衰老的mscs；
40.具体的，从1-2月龄雄性wistar大鼠骨髓中提取原代细胞，利用全骨髓贴壁法及体外传代培养，获得早代次mscs(epmscs，p2-p3)及晚代次mscs(lpmscs，p9-p10)；
41.通过形态学观察(细胞形态学特点、细胞表面积和长宽比)、衰老相关β半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色以及衰老相关因子p16
ink4a
的表达，建立复制性衰老的mscs；
42.通过甘油三酯含量检测和茜素红染色以及runx2蛋白表达水平检测明确了衰老mscs脂质合成水平以及成骨分化潜能明显降低；
43.步骤2：利用携带scd2的慢病毒感染衰老的mscs，使得衰老的mscs的脂质合成水平上调，进而延缓mscs衰老；
44.具体的，利用携带scd2的慢病毒感染衰老mscs，感染时间为48h-72h；
45.通过荧光显微镜及rt-qpcr检测其转染效率，发现病毒转染72h时，效率最佳，scd2的表达可明显上调；
46.通过sa-β-gal染色、衰老相关因子p16
ink4a
的表达检测、茜素红染色、runx2蛋白表达检测以及尼罗红染色等指标，发现scd2通过上调衰老mscs的脂质合成水平延缓mscs衰老，为体外培养获得大量年轻态mscs提供新思路和新技术，加深了对mscs衰老潜在机制的认识，有助于衰老相关疾病的预防及治疗新靶点的探索。
47.实施例1建立大鼠mscs体外复制衰老模型
48.1.1原代细胞的分离获取
49.取健康雄性wistar大鼠使其处于安静稳定状态，脱颈处死并进行消毒，之后用器械快速分离大鼠的股骨、胫骨及肱骨，将其放入50ml离心管中并用含1％双抗的pbs浸泡，随后迅速将其移入超净台；
50.将骨表面的肌肉及组织去除后，将其放入完全培养液中浸泡；
51.利用咬骨钳将骨两端的骨髓腔打开，用5-10ml注射器吸取培养液进行骨髓腔的冲洗，冲洗3-4次后见骨髓腔变成半透明即可；
52.将冲洗后的液体放入细胞过滤网上过滤，且在室温下离心处理，转速为1500rpm，
离心时间5min，之后用5ml移液器重悬细胞悬液，将其置于6cm细胞培养皿进行培养；
53.第二天进行半量换液，并继续培养，细胞融合至80％左右进行传代培养。
54.1.2构建mscs体外复制衰老模型
55.从150-180g健康wistar雄性大鼠骨髓中提取原代mscs后，通过体外传代培养至p10代左右，然后对不同代次细胞进行衰老鉴定，成功建立mscs复制性衰老模型；
56.以p2-p3mscs为早代次mscs(early passage mscs，epmscs)，p9-p10mscs为晚代次mscs(late passage mscs，lpmscs)。
57.1.3mscs形态学观察与分析
58.显微镜下观察体外传代培养获得的epmscs及lpmscs，对细胞生长状况和形态学特征进行评估，随机选取约20个视野采集图像，用cell entry软件记录并计算视野中单个细胞的表面积及长宽比，进行统计学分析。
59.1.4衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)活性检测
60.epmscs和lpmscs分别培养在6孔板中；当细胞达到70％融合时，用pbs洗涤3次，每孔加入500μl固定液固定细胞15-18min后，再次用pbs洗涤细胞；洗涤后每孔加入1ml工作液(含染色液a、染色液b各10μl，染色液c 930μl，x-gal溶液50μl)，用封口膜、保鲜膜及锡纸进行封闭与避光，在37℃无co2的孵箱里过夜；倒置相差显微镜下观察阳性细胞染色结果并进行拍照。
61.1.5荧光定量pcr(rt-qpcr)检测衰老相关因子mrna表达水平
62.(1)提取细胞rna
63.细胞生长密度至80-90％时，吸弃培养液，pbs清洗2-3次，培养皿中加入1ml trizol，室温裂解15min，反复吹打直至所有细胞完全裂解，所有液体吸入1.5ml ep管，并在4℃环境下离心处理15min，转速为12000rpm，吸取上清至另一ep管中；按200μl/ml trizol加入氯仿，剧烈震荡混和，禁止涡旋，室温静置15min，并在4℃环境下离心处理15min，转速为12000rpm，吸取上层水相至新ep管中，按照500μl/ml trizol加入异丙醇，轻轻振荡后室温静置15min，并在4℃环境下离心处理15min，转速为12000rpm，弃掉上清，管底部沉淀为rna，加入提前预冷的75％乙醇1ml，轻弹管底使沉淀悬浮，并在4℃环境下离心处理15min，转速为12000rpm，弃上清，室温干燥约10min，至其变半透明状；加入10-20μl depc水充分溶解rna，上机检测rna浓度及纯度，可根据rna浓度酌情加减depc水量。
64.(2)rna逆转录为cdna(transscript all-in-one first-strand cdna synthesis supermix for qpcr,transgen biotech)
65.根据试剂盒说明，进行如下操作：
66.表1逆转录反应体系
67.namevolumesupermix(5
×
)2μltotal rna500ng/rna浓度depc waterto volume 10μlgdna0.5μl
68.表2逆转录反应程序
69.temperaturetimecycles
40℃15min185℃5s14℃+∞ 70.合成的cdna可以直接进行qpcr或存储于-20℃冰箱；
71.表3 qpcr引物组
[0072][0073]
(3)rt-qpcr检测(transstart top green qpcr supermix,transgen biotech)
[0074]
按反应体系配制如表4：
[0075]
表4逆转录反应体系
[0076]
namevolumeforward primer0.4μlcdna2μlreverse primer0.5μlpassive reference dye(50
×
)0.4μltransstart top green qpcr supermix(2
×
)10μldepc waterto volume 20μl
[0077]
逆转录反应程序如表5：
[0078]
表5逆转录反应程序
[0079]
[0080][0081]
测出ct值并进行统计学分析。
[0082]
体外传代培养获得epmscs及lpmscs，如图1a所示，显微镜下观察到两组细胞有明显的形态学差别，epmscs生长状态良好，胞体形状为长梭形，边界清楚；而lpmscs生长状态差，形状不规则且呈铺展样，细胞边界模糊，立体感消失，胞质颗粒感较明显。如图1b对细胞形态的参数进行分析发现，lpmscs表面积较epmscs显著增大，长宽比降低。
[0083]
图1c为sa-β-gal染色结果，可见lpmscs蓝染细胞数目明显多于epmscs。统计分析发现lpmscs中蓝染细胞(sa-β-gal阳性)比例明显高于epmscs，说明lpmscs中衰老细胞数目显著增加。
[0084]
图1d是利用rt-qpcr技术检测衰老相关因子p16
ink4a
mrna水平，结果表明，相对于epmscs，lpmscs中p16
ink4a mrna表达水平明显升高。由此我们成功建立了mscs复制性衰老模型，将epmscs作为年轻细胞，lpmscs作为衰老细胞。
[0085]
实施例2衰老mscs成骨分化潜能、脂质合成水平及scd2表达的检测
[0086]
2.1茜素红染色及western blot检测细胞成骨分化能力
[0087]
将1ml0.1％明胶加入6孔板中，摇匀并在co2培养箱至少30min后，吸去明胶将mscs接种于6孔板中，细胞密度根据生长状态而定，每孔加入2ml配制的完全培养液后在细胞培养箱中培养；当细胞融合达到75％左右时，弃培养液，向孔板中加入成骨诱导分化培养液，每2-3天进行换液；诱导14-17天后，根据细胞的生长情况选择是否进行茜素红染色，如细胞数目逐渐减少，可以缩短染色时间；成骨诱导结束后，弃诱导液之后pbs洗涤2-3次，室温，4％多聚甲醛溶液进行固定，时间为25-30min；弃固定液，pbs洗涤2-3次，确保固定液清洗彻底，每孔加入2ml茜素红工作液进行染色，时间为8-10min；弃染色液，pbs洗涤2-3次后每孔加入2ml pbs，显微镜下观察染色结果，判断mscs成骨分化效果。
[0088]
如图2a所示，茜素红染色发现，与epmscs相比，lpmscs中红色的骨基质钙盐沉积明显减少。
[0089]
如图2b所示，western blot结果进一步证实，lpmscs细胞的成骨分化相关蛋白runx2表达显著降低，说明衰老mscs成骨分化潜能降低。
[0090]
2.2尼罗红染色检测细胞脂质合成水平
[0091]
将尼罗红用dmso溶解制备1mm储存液，分装冻存，避光保存；吸弃培养液，用pbs洗涤2-3次，每次3min，室温下4％多聚甲醛溶液进行固定，时间为30min；加入1
×
尼罗红工作液(1mm储存液：pbs＝1:1000)，37℃避光孵育5-10min；pbs清洗2-3次，加入dapi染液后进行37℃避光孵育，时间为5-10min，pbs轻柔清洗2-3次，同一曝光时间下，观察红色荧光强度并
拍照记录。
[0092]
如图2c所示，相比epmscs，lpmsc的红色荧光强度较弱；定量分析结果进一步证实lpmscs细胞内甘油三酯含量明显降低，因此，衰老mscs中细胞甘油三酯含量减少，脂质合成能力降低。
[0093]
2.3 rt-qpcr检测scd2 mrna表达水平
[0094]
实时定量荧光pcr方法检测epmscs与lpmscs中scd2 mrna的表达，方法同1.5，引物的序列如下：
[0095]
表6实时定量荧光pcr方法检测引物
[0096][0097][0098]
2.4 western blot检测scd2蛋白表达水平
[0099]
(1)细胞总蛋白提取
[0100]
细胞生长密度至80％以上时胰酶进行消化，完全培养液终止消化并进行吹打，将液体吸入离心管内，并在室温下离心处理5min，转速1200rpm；加入2ml pbs混悬，之后按照比例分别加入pmsf与ripa，使蛋白充分裂解，每10min振荡混匀一次，共3次，确保细胞充分裂解；裂解完全后，并在室温下离心处理25min，转速1200rpm，离心后将上层液体吸入新的1.5ml ep管中；上清即为待测的蛋白样品，可以进行后续蛋白浓度检测或冻存于-80℃。
[0101]
(2)bca法测定蛋白浓度
[0102]
使用96孔板，分别加入0、1、2、4、8、12、16以及20μl 0.5mg/ml的蛋白标准品，孔板中加pbs补齐至20μl；配bca工作液(比例为试剂a/试剂b＝50:1)，现配现用，每孔加入200μl，然后在无co2条件下，37℃培养箱中孵育30min；将96孔板放在酶标仪上检测，设置波长为562nm，测出的吸光度值，最后根据标准曲线计算出待测样品的总蛋白浓度。
[0103]
(3)蛋白印迹法步骤
[0104]
取30μg蛋白样品、sds蛋白上样缓冲液及pbs，总体系为10-20μl，封口膜封闭后煮沸5-7min；根据蛋白分子量配制8％-12％的分离胶，5％的浓缩胶，选择不同的电压(上层胶80v，下层胶120v)进行电泳；电泳完成后按照面积大小为pvdf膜＞滤纸＞凝胶准备材料，之后用甲醇进行激活，30sec后看到膜变为半透明即激活；在半干转膜仪上将滤纸-膜-凝胶-滤纸按顺序进行叠放，根据2.5倍pvdf的长宽计算电流，转膜40-50min；之后奶粉封闭1-2h，孵育不同的一抗，一抗稀释比例分别为(scd2 1:500，β-actin 1:2000，runx21:1000)，4℃过夜，次日用1
×
tbst洗膜，洗三次共30min；二抗稀释比例为1:3000，室温孵育1-2h后同样用1
×
tbst清洗，洗三次共30min；ecl超敏发光液按1:1比例避光配制，显色结束后观察结果，保存图像为tiff格式。
[0105]
图2d所示为rt-qpcr检测epmscs与lpmscs中scd2 mrna表达水平，结果显示lpmscs中scd2 mrna低于epmscs，表明衰老mscs中scd2 mrna的表达水平降低。
[0106]
图2e所示为western blot检测epmscs与lpmscs中scd2蛋白表达水平，结果显示lpmscs中scd2蛋白表达低于epmscs，说明衰老mscs衰老中scd2的蛋白表达水平降低。
[0107]
实施例3慢病毒感染衰老mscs以获得改良的衰老mscs
[0108]
构建高表达scd2的改良衰老mscs：
[0109]
由上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建稳定表达scd2的慢病毒，培养72h后获得实验组lv-scd2，用对照组慢病毒感染相同状态的衰老mscs获得对照组lv-vector；rt-qpcr检测慢病毒感染后实验组中scd2 mrna表达与对照组相比增高的倍数；western blot检测检测慢病毒感染后实验组中scd2蛋白表达与对照组相比增高的倍数。
[0110]
图3a显示scd2慢病毒过表达后，各组mscs均表达绿色荧光蛋白。
[0111]
图3b为rt-qpcr检测结果，与对照组相比，过表达组中scd2的mrna表达量提高约3.5倍。
[0112]
图3c为western blot检测结果，过表达组中scd2的蛋白表达量明显高于对照组，约为2倍。
[0113]
以上结果说明过表达scd2的慢病毒感染衰老mscs后能使scd2稳定高表达。
[0114]
实施例4改良的衰老mscs的衰老及脂质合成水平检测
[0115]
4.1检测过表达scd2对细胞衰老的影响
[0116]
4.1.1sa-β-gal染色检测细胞衰老情况
[0117]
如图4a所示，与对照组相比，lv-scd2组中的蓝染细胞数目明显减少，sa-β-gal阳性率显著下调，说明过表达scd2改善了衰老mscs的衰老情况。
[0118]
4.1.2rt-qpcr检测衰老相关因子的表达
[0119]
如图4b所示，rt-qpcr检测衰老相关因子p16
ink4a mrna的表达；结果显示：与对照组相比，lv-scd2组中p16
ink4a mrna的表达明显降低，说明改良的衰老mscs中衰老相关因子的表达明显下调。
[0120]
4.1.3茜素红染色及western blot检测细胞成骨分化能力
[0121]
如图4c所示，茜素红染色发现，与lv-vector组相比，lv-scd2组中红色的骨基质钙盐沉积明显增多。
[0122]
如图4d所示，western blot结果进一步证实，lv-scd2组中细胞的成骨分化相关蛋白runx2表达显著上调，说明过表达scd2能够促进mscs成骨分化，推测scd2可能通过抑制mscs衰老来改善其成骨分化能力。
[0123]
4.2尼罗红染色检测过表达scd2对细胞脂质合成水平的影响
[0124]
如图4e所示，相比lv-vector组，lv-scd2组中细胞具有较强的红色荧光；定量分析结果进一步证实lv-scd2组中细胞内甘油三酯含量明显增加，因此，过表达scd2能够上调衰老mscs的脂质合成能力，scd2能够通过促进脂质合成来抑制mscs衰老。
[0125]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。