减毒革兰氏阴性菌及其制备的OMV抗原递送系统的制作方法

减毒革兰氏阴性菌及其制备的omv抗原递送系统
技术领域
1.本发明是生物基因工程技术和疫苗制造领域，具体涉及一种减毒革兰氏阴性菌及其制备的omv抗原递送系统。


背景技术：

2.omv是革兰氏阴性菌释放的外膜囊泡，主要含有细菌外膜和周质成分。外膜由磷脂和脂多糖组成，脂多糖位于膜外侧，其间穿插膜蛋白。囊泡内腔可能含有来源于细菌周质或细胞质的多种物质，比如蛋白质、rna或dna、肽聚糖。因为发现omv能诱导t细胞免疫应答，许多研究已经开展，目标是调查omv组分在体内的潜在免疫力。囊泡利用受体介导的内吞作用进入细胞。囊泡的共同组分ompa也能为进入细胞起作用，并且全面激活巨噬细胞增殖。omv能够将表面蛋白提成apc细胞，自身特性决定了具有佐剂的作用，是非常理想的疫苗载体。迄今为止，第一代omv疫苗bexsero(novartis)已经批准上市，预防流行性脑脊髓膜炎b群细菌感染。还有几款omv基础的产品聚焦传染性疾病，处于临床阶段，包括肺炎、脑膜炎、百日咳等。此外，omv在辅助细菌感染宿主细胞过程中展示了一系列功能，最独特的是omv作为病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，pamp)的递送系统，装载pamp的omv和其他影响感染相关宿主应答的膜组分能传递给远端细胞。omv的免疫特性指向产生保护性粘膜免疫和杀菌抗体应答，可以为开发疫苗提供平台。使用大肠杆菌、沙门氏菌、流脑奈瑟菌来源的omv作为疫苗抗原递送系统，引起有效的b细胞应答，在很多文献中均有深入研究。
3.与传统全病原体疫苗相比，基于单一抗原的亚单位疫苗提供了更加精准的靶向性和优良的安全性。然而，这也决定了它们有较弱的免疫原性，需要另外加入佐剂提高抗原的免疫原性和激活免疫应答。不幸的是，高效低毒的可临床应用的佐剂很少，迫切需要新的安全强效佐剂。但是微生物病原体包括多种细菌细胞壁成分，如脂多糖(lps)、核酸、肽聚糖(pgn)和脂肽，以及鞭毛蛋白、细菌dna和病毒双链rna等，这些成分会导致多种不同的细胞反应，例如产生干扰素、促炎细胞因子释放、产生的免疫应答导致败血症等，限制了临床使用。
4.沙门氏菌广泛分布于自然界，常常寄居在人和动物体内，属于肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。已发现有近1000种(或菌株)，按照抗原成分可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组，其中与人疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般可以分为菌体抗原、鞭毛抗原和表面抗原3种。鼠伤寒沙门氏菌是侵袭性胞内菌，主要引起肠道感染。减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009是在野生型沙门氏菌14028s基础上敲除致病基因δmsbb和嘌呤δpuri基因的营养缺陷型菌，具有良好的肿瘤靶向性和抑瘤效果，有多款相关肿瘤治疗药物正在开展临床研究，是经临床安全验证的鼠伤寒减毒沙门氏菌，但是沙门氏菌vnp20009细胞膜中存在的鞭毛以及外毒素lps等，具有很强的毒性，容易导致败血症的产生，不适合做佐剂。而与鞭毛以及外毒素lps表达有关的基因很多，机理
复杂，图1是2019年《自然》综述的lps生物合成的机制、结构与修饰图(来源于nature reviews microbiology reviews volume 17july 2019 407)，图2是鼠伤寒沙门氏菌鞭毛结构组件与控制基因(来源于nature reviews microbiology volume 6june 2008 457)，由图1和图2可以看出选取关于lps生物合成和鞭毛结构的基因编辑策略的困难十分巨大，在基因敲除过程中常会出现菌体存活率低甚至菌体死亡的现象，对递送效果也会存在影响。腹腔接种vnp20009株的小鼠肝、脾等病理切片研究表明，vnp20009株减毒尚不充分。因此，如何构建安全有效的外膜囊泡递送系统，在疫苗研究中具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术存在的不足，本技术提供一种减毒革兰氏阴性菌及其制备的omv抗原递送系统。所述减毒革兰氏阴性菌形成的抗原递送系统具有低毒和t细胞佐剂效果。
6.本发明目的之一在于提供一种减毒革兰氏阴性菌，所述革兰氏阴性菌在野生型或原型菌株的基础上敲除或沉默基因flic、fljb和磷酸乙醇胺转移酶基因epta之后形成的菌株；在一种实施例中，是在野生型菌株的基础上依次敲除或沉默基因flic、fljb和磷酸乙醇胺转移酶基因epta之后形成的菌株。
7.本发明修饰的是革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌，在革兰氏染色实验中，首先添加了龙胆紫初染，然后添加碘液复染，第一步染色完成后，革兰氏阳性菌和阴性菌均被染为紫色，再进行洗色，只有革兰氏阴性菌会被洗去颜色变为无色，而阳性菌仍为紫色，添入另一种复染染料(通常使用番红或品红)，所有的革兰氏阴性菌染成红色或粉色，而阳性菌仍为紫色，通过这种测试我们可以区分两种细胞壁结构不同的细菌。本发明所述的革兰氏阴性菌可以为本领域常用的革兰氏阴性菌，例如可以为沙门氏菌、大肠杆菌或奈瑟菌。本发明以沙门氏菌为例，阐述omv递送系统制备过程，本发明也适用于大肠杆菌和奈瑟菌等其他革兰氏阴性菌。
8.本发明目的之二在于提供一种减毒的鼠伤寒沙门氏菌gdb520，在沙门氏菌vnp20009菌株中依次敲除或沉默基因flic、fljb和磷酸乙醇胺转移酶基因epta之后形成的菌株。
9.本发明所用的沙门氏菌vnp20009菌株，来源于atcc菌株保存中心(atcc 202165)。
10.在一些实施例中，本发明所述的基因flic的序列如seq id no.1所示，编码的蛋白的序列如seq id no.2所示。
11.在一些实施例中，本发明所述的基因fljb的序列如seq id no.3所示，编码的蛋白的序列如seq id no.4所示。
12.在一些实施例中，本发明所述的磷酸乙醇胺转移酶基因epta的序列如seq id no.5所示，编码的蛋白的序列如seq id no.6所示。
13.本发明所述的敲除或者沉默可以按照本领域的常规方法，在一些实施例中：
14.敲除基因flic的上游同源臂序列如seq id no.7所示，下游同源臂序列如seq id no.8所示；
15.敲除基因fljb的上游同源臂序列如seq id no.9所示，下游同源臂序列如seq id no.10所示；
16.敲除磷酸乙醇胺转移酶基因epta的上游同源臂序列如seq id no.11所示，下游同源臂序列如seq id no.12所示。
17.本发明还提供本发明所述的减毒革兰氏阴性菌或减毒的鼠伤寒沙门氏菌gdb520形成的外膜囊泡。本发明所述的外膜囊泡具有双层膜结构，在一些实施例中，外膜囊泡直径为20～200nm。
18.本发明所述的外膜囊泡的制备，可以按照本领域的常规方法，例如采用脱氧胆酸盐或氯化锂或类似工艺提取外膜omv，然后按照常规方法去除细胞碎片、纯化形成所需要的外膜囊泡。
19.本发明还提供一种细胞外膜囊泡omv抗原递送系统，包括本发明所述的外膜囊泡和目标抗原或核酸。本发明所述的omv抗原递送系统omv外侧可以偶联或吸附目标蛋白质抗原或者核酸，omv囊泡内也可以包覆目标蛋白质抗原或核酸，向体内细胞递送。
20.本发明还提供一种包含权利要求8所述的抗原递送系统的疫苗制剂。在一些实施例中，所述疫苗制剂是将抗原蛋白或核酸与本发明所述的外膜囊泡omv抗原递送系统进行包埋或偶联形成。
21.本发明所述的抗原蛋白与本发明所述的外膜囊泡omv抗原递送系统进行包埋或偶联可以按照本领域的常规方法进行。
22.本发明所述的抗原蛋白可以为本领域常用的抗原蛋白，例如预防性疫苗的抗原蛋白或者肿瘤疫苗的抗原蛋白，可以是采用基因工程的方法表达纯化的病毒或细菌的抗原蛋白。
23.本发明所述的减毒的鼠伤寒沙门氏菌gdb520，通过按照特定顺序敲除或沉默基因flic、fljb和磷酸乙醇胺转移酶基因epta，使改善后的菌株不含有鞭毛蛋白且lps分子结构发生改变，具有低毒和t细胞佐剂效果，且能够正常扩增培养，具有重要的工业价值。可以用于制造预防性疫苗和肿瘤疫苗，可以实现注射或鼻喷等给药。
附图说明
24.图1为脂多糖lps生物合成、结构与修饰；
25.图2为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛组件；
26.图3为实施例1的pcr电泳鉴别图；
27.图4为vnp20009野生型电镜图；
28.图5为基因敲除后获得的菌株gdb520(δflic+δfljb+δepta)的电镜图；
29.图6为实施例2的omv囊泡电镜图；
30.图7为实施例3的细胞因子表达水平。
具体实施方式
31.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
32.本发明实施例中所采用的沙门氏菌vnp20009，来源于atcc菌株保存中心(atcc 202165)，需要特别说明的是，本发明实施例所用的方法，同样适用于大肠杆菌和流脑奈瑟
菌等革兰氏阴性菌。
33.实施例1减毒的鼠伤寒沙门氏菌gdb520的构建
34.1、δflic菌株的构建
35.采用cas9λred同源重组质粒对vnp20009进行flic基因敲除。cas9λred质粒具有kan抗性，表达重组蛋白；crispr grna质粒具有amp抗性，携带grna序列。基因flic的序列如seq id no.1所示，编码的蛋白的序列如seq id no.2所示。
36.设计20bp的grna序列打靶为：5
’‑
aacgaaatcgaccgtgtatc-3’，敲除基因flic的上游同源臂序列如seq id no.7所示，下游同源臂序列如seq id no.8所示。
37.含cas9λred同源重组质粒的vnp制备：将vnp单克隆接种于2ml lb培养基中，37℃培养至od600＝0.6，离心收集菌体，用预冷的10％甘油洗菌体3次，再用10％甘油重悬100μl。将cas9质粒10μl加入细胞电转，条件设置：2400v，200ω，1mm。然后涂板30℃，kan抗性培养，过夜挑取单克隆，即为vnp-cas9。
38.用grna质粒转化vnp-cas9制备感受态细胞：将vnp-cas9单克隆接种于2ml lb培养基中，30℃培养至od600＝0.3～0.5，加入阿拉伯糖诱导，浓度3mg/ml，孵育1hr，离心收集菌体，用10％甘油洗3次，重悬100μl。将grna质粒与同源序列加入感受态细胞中，电转2400v，200ω，2mm。然后涂布在lb平板上，kan+和amp+，孵育16hr以上，挑取单克隆，扩增培养。
39.去除单质粒：将iptg加入培养基中，过夜培养，传2代，除掉grna质粒，此时vnp丢失amp抗性，挑单克隆培养传代保持种子，即为vnpδflic。
40.2、在vnpδflic基础上δfljb菌株的构建
41.基因fljb的序列如seq id no.3所示，编码的蛋白的序列如seq id no.4所示。
42.设计20bp的grna序列打靶为：5
’‑
gtttacggtattgcccaggt-3’，敲除基因fljb的上游同源臂序列如seq id no.9所示，下游同源臂序列如seq id no.10所示。
43.用grna质粒转化vnpδflic制备感受态细胞：将vnpδflic单克隆(含有cas9质粒，kan抗性)接种于2ml lb培养基中，30℃培养至od600＝0.3～0.5，加入阿拉伯糖诱导，浓度3mg/ml，孵育1hr，离心收集菌体，用10％甘油洗3次，重悬100μl。将grna质粒与同源序列加入感受态细胞中，电转2400v，200ω，2mm。然后涂布在lb平板上，kan+和amp+，孵育16hr以上，挑取单克隆，扩增培养。
44.去除单质粒：将iptg加入培养基中，过夜培养，传2代，除掉grna质粒，此时vnp丢失amp抗性，挑单克隆培养传代保持种子，即为vnpδflic+δfljb。
45.3、在vnpδflicδfljb基础上敲除epta基因
46.磷酸乙醇胺转移酶基因epta的序列如seq id no.5所示，编码的蛋白的序列如seq id no.6所示。
47.设计20bp的grna序列打靶为：5
’‑
ggcgaatcattgggtgaaaa-3’，敲除磷酸乙醇胺转移酶基因epta的上游同源臂序列如seq id no.11所示，下游同源臂序列如seq id no.12所示。
48.用grna质粒转化vnpδflicδfljb制备感受态细胞：将vnpδflicδfljb单克隆(含有cas9质粒，kan抗性)接种于2ml lb培养基中，30℃培养至od600＝0.3～0.5，加入阿拉伯糖诱导，浓度3mg/ml，孵育1hr，离心收集菌体，用10％甘油洗3次，重悬100μl。将grna质粒与同源序列加入感受态细胞中，电转2400v，200ω，2mm。然后涂布在lb平板上，kan+和amp+，
孵育16hr以上，挑取单克隆，扩增培养。
49.去除双质粒：将iptg加入培养基中，过夜培养，传2代，除掉grna质粒，此时vnp丢失amp抗性，挑单克隆培养传代，提高培养温度至37℃过夜，去除cas9质粒，保持种子，即为vnpδflic+δfljb+δepta。
50.所获得的依次敲除基因flic、fljb和磷酸乙醇胺转移酶基因epta之后形成的菌株，命名为gdb520株。
51.4、鉴别基因敲除情况
52.通过以下引物鉴别epta敲除情况：
53.上游引物：5
’‑
tccagttcagcagtatgtcgcc-3’54.下游引物：5
’‑
actgcctgccttgagcatcaac-3’55.pcr测序野生株序列区间为：4440721-4443323，理论上共2603nt，实际测序结果1059nt，序列如seq id no.13所示。
56.pcr电泳鉴别图如图3所示，表明已成功敲除epta。通过电镜观察，如图4所见，vnp20009野生型电镜可见鞭毛(图4)，基因敲除后获得的菌株gdb520(δflic+δfljb+δepta)，电镜照片可见鞭毛被敲除(图5)。
57.实施例2外膜囊泡(omv)的提取、制备与表征
58.将实施例1获得的菌株gdb520扩大培养，将种子液按照1:100(体积比)的比例，接种于发酵基础培养基(配比为：植物蛋白胨20g/l、酵母提取物20g/l、葡萄糖
·
h2o 5g/l、磷酸氢二钾3g/l、磷酸二氢钾2g/l、无水硫酸镁2g/l、氯化钠14g/l)中。发酵参数设置ph 7.0、转速150rpm、温度37℃、罐压0.02mpa、通气量60l/min。
59.在发酵过程中，每1小时测定一次od600值；每2小时镜检一次；ph值分别用氨水和6m盐酸调节，应控制在6.8～7.2；控制溶氧＞30％。发酵第6小时，细菌进入对数生长期，收获菌体。将0.01m pbs加入到装有菌体沉淀的离心筒内，搅拌重悬洗涤菌体，洗涤2次，离心收集沉淀-20℃冷冻保存。冷冻至少24hr，从-20℃取出菌体，2-8℃解冻18～24小时。按照1:10的比例进行菌体重悬，依据菌体湿重每克菌体加10ml脱氧胆酸钠提取液(浓度0.5％)，42℃震荡提取omv。然后8000g离心去除细胞碎片，用300kda切向流超滤器反复洗涤10个体积，浓缩收集膜上液。再加入核酸酶去除核酸杂质，柱层析sepharose 4ff收集omv纯品，即为可以用为递送系统的omv囊泡(球)，后续可以进行包埋和偶联来递送抗原。取样拍摄电镜进行表征如图6所示，直径为20～200nm。
60.实施例3免疫细胞应答试验
61.mem培养基添加10％血清培养raw264.7巨噬细胞，用实施例2制备的omv刺激巨噬细胞12小时，对照组为pbs蔗糖溶液，再用trizoi裂解细胞提rna，rna逆转录为cdna，q-pcr检测表达量，δcδct法计算细胞因子表达水平。结果如图7所示，炎症因子il-6表达水平显著下降，ifn-γ保留并提升，可见实施例2制备的omv完全满足疫苗佐剂设计和抗原递送系统的要求。