用于检测黄瓜对灰霉病抗性性状的SNP分子标记及其应用

用于检测黄瓜对灰霉病抗性性状的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术辅助育种技术领域，特别是涉及用于检测黄瓜对灰霉病抗性性状的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.黄瓜是我国重要的蔬菜作物，尤其在设施生产中占有举足轻重的地位，2017年栽培面积为123.52万公顷，产量达到6482.46万吨(张圣平、顾兴芳,2020)。黄瓜灰霉病是由灰葡萄孢(botrytiscinerea)侵染所引起的、发生在黄瓜上的病害，主要危害黄瓜的花、瓜条、叶、茎，病菌多从开败的雌花侵入，致花瓣腐烂，并长出灰褐色霉层，随着病情的发展，逐步向幼瓜扩展，被害花和幼瓜的蒂部初呈水渍状，褪色，病部逐渐变软、畏缩、腐烂，表面密生灰褐色霉状物，以后花瓣枯萎脱落。近年来，灰霉病已成为制约我国保护地黄瓜生产的重要病害，一般可导致蔬菜减产20％～30％(郑果、杜蕙,2006)，造成严重的经济损失。研究黄瓜抗灰霉病的遗传规律及分子标记，对于选育符合市场需求的抗病新品种具有重要意义。
3.关于控制黄瓜抗灰霉病资源的评价和筛选，封林林等(2006)从国家蔬菜中期种子库中选出96份黄瓜材料进行灰霉病抗病性鉴定，筛选出19份抗病材料。
4.研究植物抗灰霉病的遗传规律，开发与抗病基因连锁的分子标记可为分子标记辅助育种、选育优良抗灰霉病新品种奠定基础。但在黄瓜中关于抗灰霉病的遗传规律、分子标记及基因定位等分子生物学研究尚未见报道。曹娴等(2011)利用集群分离分析法(bsa)和ssr分子标记技术，以草莓高感亲本达赛莱克特(89)与高抗亲本甜查理(103)的f2群体为材料，发现草莓灰霉病抗性受1对显性单基因控制，并鉴定1个距离抗病基因15.9cm的连锁标记uffxa01h05。李君明(2005)利用多毛番茄pi134417与99165-30构建的bc1群体进行抗性鉴定，认为番茄抗灰霉病为数量性状并鉴定出2个qtls位点，同时鉴定了与抗灰霉病位点qtllygm7-1紧密连锁的t1255caps标记，并在不同类型的试验材料中进行验证。zhang等(2016)利用番茄感抗双亲杂交获得的f2群体鉴定了3个qtl位点，其中rbcq2和rbcq4与植物发病率有关，rbcq1与病斑扩散速度有关。anuradha等(2011)在鹰嘴豆中检测到3个与灰霉病抗性相关qtl位点。这些qtls和分子标记为植物抗灰霉病机制研究和分子标记辅助育种奠定了基础，也为黄瓜抗灰霉病的研究提供了借鉴。
5.因此挖掘抗灰霉病基因是植物抗灰霉病研究的关键问题。在其他植物中关于灰霉病抗病基因已有一定的研究基础，但在黄瓜中的研究甚少。
6.拟南芥中的2个vq基因，vq12和vq29对植物抗灰霉病起负调控作用。wang等(2015)发现vq12和vq29表达受到抑制的植株对灰霉病菌产生抗性，并且vq12和vq29在物理上相互作用，它们的表达可能部分依赖于ja信号通路。mpk3基因的表达与sa、ja有关，主要参与拟南芥的基础抗病性；mpk6与拟南芥pti诱导产生的抗病性有关(tanakaetal.,2006；gallettietal.,2011)。hdtf1是ja通路的负调控因子，可以激活ja信号使ja积累，棉花受到灰霉病菌侵染后hdtf1表达下调。hdtf1表达受到抑制后，可以显著增强棉花灰霉病菌的抗性(gaoetal.,2016)。
7.kishimoto等(2004)过表达黄瓜中chi2基因后，发现与非转基因黄瓜相比，转基因黄瓜在接种后灰霉病症状减轻。值得注意的是，去除转基因黄瓜叶片中chi2后，叶片对灰霉病菌仍有抑制作用。可能是由于过表达chi2加强了其他内源性防御反应。因此，黄瓜对灰霉病菌侵染不是单一的反应机制，灰霉病菌侵染时，体内茉莉酸甲酯、水杨酸和脱落酸等植物激素会诱导黄瓜功能蛋白激酶cspti1-l的表达，从而延缓灰霉病的发生(oh etal.,2014)。kong等(2015)利用rna-seq发现灰霉病相关基因主要富集在“脂肪酸降解”、“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解”、“光合作用”、“α-亚麻酸代谢”和“乙醛酸和二羧酸代谢”等途径。csa2g010390基因富集在“防御响应真菌”途径，推断csa2g010390可能是黄瓜防御灰霉菌的候选基因。liu等(2020)通过分析黄瓜wrky家族基因，发现wrky10介导黄瓜灰霉病的防御反应。
8.截止目前，尚未见与bc基因连锁的植物抗灰霉病的分子标记的报道。


技术实现要素：

9.本发明的目的之一是针对上述问题，提供一种用于检测黄瓜对灰霉病抗性性状的snp分子标记，所述snp标记的位点为黄瓜6号染色体物理位置第27,919,339bp处，该位点的碱基是a或t，该位点碱基为a的黄瓜材料为感灰霉病黄瓜材料，该位点碱基为t的黄瓜材料为抗灰霉病黄瓜材料。
10.所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示,其中第199位碱基是a或t。
11.本发明的另一目的是提供一种用于检测上述的snp分子标记的特异性引物对，包括引物snpbc-ecori-f、snpbc-ecori-r，所述引物的核酸序列如下：
12.snpbc-ecori-f:5'-gtattgctgctacttccgct-3'，
13.snpbc-ecori-r:5'-atttcaacgaatccatgtcaagcac-3'。
14.本发明的再一目的是提供一种用于检测上述的snp分子标记的试剂盒，包含上述的特异性引物对。
15.优选地，所述试剂盒还包含黄瓜基因组dna提取试剂、pcr扩增反应试剂、pcr扩增产物测序试剂或者snp差异位点识别试剂；优选所述snp差异位点识别试剂包括能够识别snp差异位点的限制性内切酶，优选还包括聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂；优选所述限制性内切酶为ecori。
16.本发明的最后目的是提供上述的snp分子标记在如下(1)-(5)任一中的应用：
17.(1)鉴定或辅助鉴定黄瓜抗/感灰霉病材料；
18.(2)鉴定或辅助鉴定黄瓜抗/感灰霉病基因bc基因；
19.(3)筛选或者辅助筛选抗灰霉病黄瓜品种；
20.(4)培育或者辅助培育抗灰霉病黄瓜品种；
21.(5)黄瓜育种。
22.所述应用包括以下步骤：提取待测样品的基因组dna作为模板，采用上述的snp分子标记的扩增引物进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行测序或酶切电泳检测，所述酶切电泳检测指采用能够识别所述snp分子标记差异位点的限制性内切酶对pcr扩增产物进行酶切，然后对扩增产物进行电泳，优选所述电泳采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
23.所述snp分子标记的扩增引物如下：
24.snpbc-ecori-f:5'-gtattgctgctacttccgct-3'，
25.snpbc-ecori-r:5'-atttcaacgaatccatgtcaagcac-3'。
26.pcr扩增获得224bp片段，当采用测序检测时，pcr扩增片段的第199位碱基是a的黄瓜材料为感灰霉病黄瓜材料，pcr扩增片段的第199位碱基是t的黄瓜材料为抗灰霉病黄瓜材料；
27.当采用酶切电泳检测时，所述限制性内切酶为ecori，如果酶切后电泳得到224bp的条带，则检测对象为感灰霉病材料；如果酶切后电泳得到196bp的条带，则检测对象为抗灰霉病材料。
28.pcr扩增的反应体系为：7.5ngdna模板，所述引物的正向引物和反向引物各50ng，5μl2
×
3gtaqmastermixforpage(reddye)，加双蒸水至10ul；
29.ecori酶切的体系为：pcr产物3μl，内切酶0.3μl，nebcutsmartbuffer1μl，双蒸水5.7μl。
30.所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟；
31.酶切温度为37℃，酶切时间为2h。
32.本试验以感灰霉病自交系9930和抗灰霉病自交系9110gt为材料开发snp标记，通过利用40份自然群体材料进行验证，结果显示标记snpbc-ecori用于分子标记辅助选择的正确率为92.5％。
33.本发明不仅为黄瓜抗灰霉病基因bc的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育抗灰霉病的黄瓜新品种提供了高效的途径。本发明基于开发的snp标记提供用于辅助筛选具有抗灰霉病基因的黄瓜新品种的应用，采用所述snp27919339特异性引物扩增待测材料的dna，然后对扩增产物进行测序或酶切电泳检测，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行抗灰霉病的筛选，具有高效、限制少、准确的优点，提高选育黄瓜抗灰霉病品种的效率，缩短育种周期。
附图说明
34.图1是snp标记snpbc-ecori对黄瓜亲本材料9110gt(p1)，9930(p2)，f1世代单株的检测结果；p1：9110gt(抗灰霉病)；p2：9930(感灰霉病)。
35.图2是snp标记snpbc-ecori对黄瓜40份自然群体材料的检测结果，泳道从左至右为：泳道1：dnamarker，2：9930，3：9110gt，4：f1单株，5-44：40份自然群体材料。
具体实施方式
36.下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
37.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。
38.材料与方法
39.本研究所用的试验材料为黄瓜9110gt(p1)，9930(p2)，亲本杂交f1，以及本课题保存的40份黄瓜自然群体材料。
40.9110gt是华北型和欧洲型黄瓜杂交后代，雌性系，无限生长类型，抗灰霉病。瓜长33厘米左右，白刺、密，瘤极小，无棱，无纹。为现有已知品种。在苗晗等人于2012年在《中国农业科学》第45卷第22期第4552-4560页上发表的文章《利用永久群体在不同环境下定位黄瓜株高qtl》中也有记载。
41.9930为华北密刺型黄瓜，普通花性，植株易自封顶，感灰霉病。瓜长35厘米左右，白刺、密，瘤中等大小，无棱，无纹。为现有已知品种。在苗晗等人于2012年在《中国农业科学》第45卷第22期第4552-4560页上发表的文章《利用永久群体在不同环境下定位黄瓜株高qtl》中也有记载。
42.9110gt、9930在中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
43.snpbc-ecori标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用dcapsfinder软件和primer3.0软件设计，并在北京生工公司合成。重测序的基因组信息详见qi等在《nature genetics》杂志2013年发表的论文《agenomicvariationmapprovidesinsightsintothegenetic basisofcucumberdomesticationanddiversity》。
44.主要试剂
45.pcr实验使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司(vazyme公司)的2
×
3gtaqmaster mixforpage(reddye)；酶切使用nebuffercutsmart的限制性内切酶ecori；凝胶电泳使用北京酷来搏科技有限公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。测序在北京生工公司进行。
46.实施例1.黄瓜抗灰霉病基因连锁的snp标记的获得
47.在前期研究中我们利用3个ssr标记，3个indel标记和2个snp标记，将黄瓜抗灰霉病基因bc定位在6号染色体上标记bcsnp2和bcsnp6之间，该区段的物理距离439.27kb。基于以上结果，我们开展了本研究。
48.结合黄瓜基因组序列的数据和黄瓜材料9110gt、9930的重测序数据，利用生物信息学结合遗传群体的表型鉴定，分析定位该区域内的snp，发现黄瓜6号染色体物理位置第27,919,339bp处，在黄瓜材料9930(p2)基因组中该位点碱基为a；在材料9110gt(p1)基因组中该位点碱基为t；从而找到分子标记snp27919339a/t。
49.基于获得的与黄瓜抗灰霉病基因连锁的snp标记snp27919339，开发与黄瓜抗灰霉病基因连锁的dcaps标记(命名为snpbc-ecori)。通过黄瓜基因组数据库网站(http://cucurbitgenomics.org/)下载黄瓜6号染色体参考基因组(华北型黄瓜品系9930的参考基因组序列，版本号为v2)的上述区段的dna序列，利用引物设计软件primer3.0设计1对引物，其中正向和反向引物分别为：
50.snpbc-ecori-f(seq id no.1):5'-gtattgctgctacttccgct-3'，snpbc-ecori-r(seq id no.2):5'-atttcaacgaatccatgtcaagcac-3'。
51.由于上述所得snp的关系(snp＝a/t)，当碱基a存在时，不能形成内切酶ecori的识别序列(g
↓
aatt
↑
c，
↓↑
为酶切位点)，扩增片段无法被内切酶ecori切开；当碱基t存在时，形成内切酶识别序列，扩增片段可以被内切酶ecori切开。
52.通过上述引物(snpbc-ecori-f/snpbc-ecori-r)对双亲材料9930、9110gt进行pcr扩增，在材料9930(感黄瓜灰霉病)中，获得一个224bp的条带(核苷酸序列如seq idno.3所
示)，在材料9110gt(抗黄瓜灰霉病)中也获得一个224bp的条带(核苷酸序列如seq id no.4所示)，结合内切酶ecori对扩增片段进行酶切，获得特异性条带，材料9930的pcr扩增条带经酶切步骤后仍然为224bp，材料9110gt的pcr扩增条带经酶切获得一个196bp的条带(核苷酸序列如seq id no.5所示)。
53.具体操作方法：
54.步骤1.dna提取和pcr扩增
55.取黄瓜植株的嫩叶，用改良的ctab(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本9110gt(p1)和9930(p2)，以及它们的杂交f1和40份自然群体各单株的基因组dna。
56.dcaps标记pcr反应体系为：总反应体系10μl，3μldna(5.0ng/μl)，正向和反向引物(50ng/μl)各1μl，5μl2
×
3gtaqmastermixforpage(reddye)(vazyme公司产品)。
57.pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
58.步骤2.ecori完全酶切pcr产物
59.酶切体系为：pcr产物3μl，内切酶0.3μl，nebuffer1μl，双蒸水5.7μl。酶切温度为37℃，酶切时间为2h。
60.步骤3.结果判定
61.方法一：跳过步骤2，不经过酶切，将pcr产物直接测序。9930(感黄瓜灰霉病)所得序列在第199位碱基为a；9110gt(抗黄瓜灰霉病)所得序列在199位碱基为t；f1所得序列该位置有两种碱基，a和t同时存在。
62.方法二：经过内切酶完全酶切，酶切产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5
×
tbe，150v恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色，统计带型。
63.9930(感黄瓜灰霉病)得到一个为224bp的片段，条带带型记为a；9110gt(抗黄瓜灰霉病)得到一个196bp的片段条带带型记为b；f1中两个条带同时检测到，条带带型记为h。
64.实施例2.bc基因snp标记的验证
65.利用表1所列的本课题保存的40份黄瓜自然群体材料，对实施例1获得的与bc基因连锁的标记snpbc-ecori进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性，田间鉴定和分子验证结果如表1中所示：
66.表1.40份黄瓜自然群体材料感/抗黄瓜灰霉病田间表型和分子验证结果
67.材料名称田间表型分子验证表型 材料名称田间表型分子验证表型cg833.09a cg2512.35bcg1640.89a cg5819.68bcg1732.88a cg11418.54bcg3236.11a r816.50bcg3552.47a r1321.91bcg3740.56a r1617.70bcg4332.28a r1922.97bcg7132.42a r2820.23bcg9635.93a r3121.13bcg10233.59a r3916.80b
cg10527.78b r4420.76bcg11738.59a r5122.21br438.34a r749.50ar3442.00a r5419.33br7737.86a r8915.58ar8331.96a r9018.74br8434.33a r11719.71br9535.10a r12420.20br10031.52a r13719.33br14836.57a r16320.24b
68.*注：田间表型利用病情指数表示，根据群体病情指数分布情况，以病情指数等于25为界限，病情指数小于25被认为是抗灰霉病，大于25被认为是感灰霉病。经调查，上表40份材料的田间表型数据为：有20份为抗灰霉病，有20份为感灰霉病。
69.按照实施例1中的方法进行snp标记的检测，pcr扩增条带按照实施例1步骤2方法酶切后采用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，条带见图2，结果显示，检测到21份材料的条带带型为a(感黄瓜灰霉病)，19份材料的条带带型为b(抗黄瓜灰霉病)。本发明的snp标记在40份自然群体材料带型反映的表型数据与田间调查结果相比，经计算正确率为92.5％。可用于鉴定或筛选抗灰霉病材料。