一种杂交瘤细胞及其分泌的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体的制作方法

1.本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞及其分泌的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)引起的猪高度接触性肠道传染病。主要危害2周龄以内的仔猪，典型症状为水样腹泻、脱水、呕吐等，ped是世界上流行最广泛的猪病之一。对于养猪行业，以2d～10d的哺乳仔猪发病最为严重，发病率可达100％，病死率达50％～90％。猪流行性腹泻对于养猪业造成了巨大的经济损失。
3.pedv为有囊膜不分节段单股正链rna病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属i群成员，全长约28 000nt，主要结构蛋白有纤突(spike，s)蛋白、膜(membrane，m)蛋白、小膜(envelope，e)蛋白和核衣壳(nucleocapsid，n)蛋白。其中n蛋白是pedv已知结构蛋白中唯一的磷酸化蛋白，由441个氨基酸组成，也是组成病毒核衣壳的结构基础。n蛋白具有保守性强的特点，猪在感染pedv早期，体内就能产生高水平的抗n蛋白抗体。因而利用n蛋白建立pedv分子生物学诊断技术具有很好的应用前景。因此，n蛋白是早期准确判断pedv感染的靶蛋白，同时也普遍用于ped疫苗免疫效果的评估。
4.昆虫杆状病毒表达系统(baculovirus expression vector system,bevs)以昆虫杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞为受体的表达系统。在杆状病毒基因中p10基因和多角体蛋白基因都是极晚期基因，它们的启动子能够高效表达目的蛋白，昆虫细胞与哺乳动物细胞翻译和翻译后蛋白修饰的模式与能力相似，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，得到的重组蛋白抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似；能容纳大分子的插入片段；容易实现大规模低成本生产。该表达系统日益受到人们的重视和广泛应用。
5.化学发光酶联免疫方法(chemiluminescentenzyme immunoassay,cleia)是将化学发光体系与酶联免疫分析技术相结合，以化学发光强度与反应物浓度的正比关系，检测微量抗原或抗体的一种新型免疫测定技术。该技术与普通间接elisa检测方法相比，操作简单，反应时间短；可通过绘制标准曲线实现定量分析；敏感性与精确度明显优于其他方法，标准阳性样本检出率可高达100％；检测范围很广，可达6个数量级。目前，该方法已被广泛应用于人体外诊断试剂如肿瘤标记物检测，丙型肝炎、艾滋病抗体检测，食品安全检测等项目，但在动物疫病检测领域应用尚不广泛。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种杂交瘤细胞及其分泌的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体特异性强，灵敏度高，可以用于pedv检测，具有较
高的准确率。
7.第一方面，本发明提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏编号为：cctcc no:c2021278。
8.本发明针对该杂交瘤细胞进行了保藏，保藏信息如下：
9.保藏编号：cctcc no:c2021278，分类命名：杂交瘤细胞株pedv-n-3c8；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学邮编：430072；保藏日期：2021年9月30日。
10.本发明进一步提供由所述的杂交瘤细胞分泌得到的单克隆抗体。
11.进一步地，所述单克隆抗体和猪流行性腹泻病毒的n蛋白产生特异性免疫反应。
12.本发明进一步提供一种猪流行性腹泻病毒的抗原表位肽，所述抗原表位肽可以和所述的单克隆抗体特异性结合。
13.本发明进一步提供一种核酸，所述核酸用于编码所述单克隆抗体。
14.本发明进一步提供一种生物材料，所述生物材料包括所述的核酸，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
15.第二方面，本发明提供所述杂交瘤细胞，或所述单克隆抗体，或所述的核酸在制备猪流行性腹泻病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
16.本发明进一步提供用于检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，包括所述单克隆抗体。
17.进一步地，所述试剂盒为竞争性化学发光酶联免疫试剂盒。
18.本发明具备如下有益效果：
19.本发明基于课题组前期分离的基因iii群pedv变异强度株(pedv-hncadc-2017株)，利用昆虫杆状病毒表达系统对保守性强、覆盖多抗原位点的pedv n基因进行高效表达，并根据表达得到的n蛋白制备得到一种杂交瘤细胞株pedv-n-3c8，该杂交瘤细胞株可以分泌制备抗n蛋白单克隆抗体。以重组n蛋白、抗n蛋白单克隆抗体为基础，通过优化反应条件，建立pedv抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法。
20.本发明提供的n蛋白单克隆抗体具备优异的灵敏度和特异性，要显著超过原核表达和合成多肽无法达到的，建立的血清学检测方法覆盖pedv的全部基因群。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1是本发明实施例1提供的pfastbac-n质粒酶切结果；其中m:dl-10000dna相对分子质量标准；1：pfastbac-n未酶切；2：pfastbac-n双酶切。
23.图2是本发明实施例1提供的bacmid-n pcr鉴定结果；其中m：dl-5000dna相对分子质量标准；1：bacmid-n质粒；2：阴性对照。
24.图3是本发明实施例1提供的重组杆状病毒rbv-n拯救(200x)结果；其中a：正常sf9细胞；b：重组杆粒bacmid-n转染sf9细胞病变。
25.图4是本发明实施例1提供的western blot鉴定结果；其中m：蛋白质相对分子质量
标准；1:rn蛋白；2:sf9细胞蛋白对照。
26.图5是本发明实施例1提供的间接免疫荧光(ifa)结果；其中a：pedv-n-3c8单抗；b:pbs阴性对照。
27.图6是本发明实施例1提供的pedv-n-3c8 western blot结果；其中m：蛋白质相对分子质量标准；1：pedv-n-3c8腹水为一抗；2：抗his标签单抗为一抗。
28.图7是本发明实施例1提供的校准品(抗体剂量值为0～200ncu/ml)绘制曲线图。
29.图8是本发明实施例1提供的roc曲线绘制结果。
具体实施方式
30.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
32.实施例1
33.1、材料和方法
34.1.1载体、菌种猪流行腹泻病毒(pedv-hncadc-2017株)由本发明分离保存，保藏号：v201766，专利号：zl201810316634.6；sf9细胞购自北纳生物；pfastbachta载体购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；jm109感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；dh10bac感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrs)、猪瘟病毒(csfv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪口蹄疫病毒(fmdv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪δ冠状病毒(pdcov)、猪轮状病毒(rv)、pedv阳性血清、大肠杆菌阳性血清、pedv阴性血清和spf猪血清由河南省动物疫病预防控制中心保存。
35.1.2主要试剂及耗材核酸提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司；反转录试剂盒购自takara公司；杆状病毒穿梭载体小量抽提试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；sf-900ii sfm培养基、opti-mem
tm
i培养基、cellfection ii转染试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；限制性内切酶、premix ex taqdna聚合酶、dna marker、t4 dna连接酶、iptg以及分子克隆所用其他试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；his标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)购置康为世纪；ht、hat、聚乙二醇(peg2000)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自sigma公司；hrp标记羊抗小鼠igg购自abbkine公司；抗his标签单抗购自北京索莱宝生物科技有限公司；surepage
tm
预制胶、his标签蛋白购自南京金斯瑞生物科技公司；发光底物液由洛阳莱普生信息科技有限公司提供；lumo化学发光仪购自郑州安图生物工程股份有限公司；免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒购自sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。
36.1.3实验动物6～8周龄、12～16周龄spf级balb/c小鼠，购自郑州大学实验动物中心。
37.1.4试验方法
38.1.4.1引物设计与合成参考本实验分离株pedvn基因全长序列，在n段加入kozak序列，上下游分别添加ecor i和sal i酶切位点，将该段序列进行杆状病毒表达偏爱密码子优化，由南京金斯瑞生物科技公司合成。鉴定引物m13f/r由郑州尚亚生物公司合成。
39.1.4.2重组穿梭质粒pfastbac-n的构建与鉴定将合成的n基因与pfastbac
tm
ht经ecor i、sal i双酶切，胶回收后用t4 dna连接酶连接，转化至jm109感受态细胞中，挑取单菌落进行pcr及酶切鉴定，将酶切正确的重组质粒命名为pfastbac-n。
40.1.4.3重组杆粒bacmid-n的制备将重组质粒pfastbac-n转化到dh10bac感受态细胞中，并涂布于蓝白斑筛选平板；含有硫酸卡钠霉素(50μg/ml)、四环素(7μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)、iptg(40μg/ml)、x-gal(40μg/ml)的lb平板，37℃培养48h。挑取较大的白色菌落在上述平板上进行划线接种，37℃培养48h。挑取单个菌落接种至于硫酸卡钠霉素(50μg/ml)、四环素(7μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)三抗lb液体培养基中，振荡培养12h。质粒经杆状病毒穿梭载体小量抽提试剂盒抽提，并经m13f/r pcr鉴定正确，命名为bacmid-n。
41.1.4.4重组杆状病毒rbv-n的制备将sf9细胞铺至6孔板中，在2个100μl opti-mem
tm
i培养基中分别加入4μlcellfection ii转染试剂和4μg阳性重组杆粒，轻轻混匀后静置15min，再将二者轻轻混匀，静置20min后缓慢加入到6孔板中。28℃培养6h后更换培养基为sf-900ii sfm培养基。28℃培养5-6d，待大部分细胞出现明显病变后收取细胞上清液为第1代重组杆状病毒，后继续盲传3代，命名为rbv-n。
42.1.4.5重组n蛋白的纯化将重组杆状病毒rbv-n接种sf9细胞，28℃培养5d-6d后收集细胞沉淀进行超声波裂解，取上清利用his标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)进行镍柱纯化，获得纯化的重组n蛋白(rn)。
43.1.4.6重组n蛋白的特异性鉴定
44.1.4.6.1间接elisa方法：提取纯化后rn蛋白包被elisa板，采用间接elisa方法，测定重rn蛋白与pedv、prrs、csfv、prv、fmdv、tgev、pdcov、rv阳性血清特异性结合情况。
45.1.4.6.2western-blot鉴定：取纯化后rn、sf9细胞蛋白进行sds-page电泳，转印至nc膜上，10％脱脂乳封闭后，以pedv多抗鼠血清为一抗，羊抗鼠hrp为二抗，进行western-blot鉴定。
46.1.4.7动物免疫与细胞融合取100μg/只rn蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，背部皮下免疫balb/c小鼠，免疫4次，每次间隔14d，融合前3d，腹腔注射rn蛋白加强免疫。无菌摘取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞混合均匀，离心后轻弹底部使其疏松，逐滴加入1ml 37℃预热的聚乙二醇peg2000，边滴加边旋转离心管，温浴90s后逐滴加入不完全dmem培养基，离心后加入适量hat选择培养液，100μl加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5％co2、37℃培养箱培养。
47.1.4.8杂交瘤的筛选融合后第5天用hat培养液进行第1次半量换液，第9日进行全换液，待细胞长到孔底的1/4～1/3时吸出80μl上清分别加至pedv包被板、rn蛋白包被板进行elisa检测，以p/n≥2.1作为阳性判断标准，以免疫阳性血清作阳性对照，正常小鼠血清作阴性对照。对检测结果为双阳性的孔进行亚克隆，经3次亚克隆定株后扩大培养。
48.本发明得到一株杂交瘤细胞，并对其进行了保藏，保藏信息如下：
49.保藏编号：cctcc no:c2021278，分类命名：杂交瘤细胞株pedv-n-3c8；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学邮编：430072；保藏日期：2021年9月30日。
50.1.4.9腹水制备与效价测定12～16周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂2ml，7～10日后每只小鼠腹腔接种l
×
106～5
×
106个杂交瘤细胞，经7～10日后采集
腹水。采用protein g hp亲和层析柱配合蛋白液相层析系统对抗体进行纯化脱盐。
51.1.4.10单克隆抗体的鉴定
52.1.4.10.1抗体亚类鉴定采用sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，具体步骤按试剂盒的说明书操作。
53.1.4.10.2特异性鉴定采用间接elisa法，利用所获得的1株单克隆抗体与pedv、rn蛋白、sf9昆虫细胞蛋白检测特异性反应，以p/n≥2.1判为阳性，检测同时设空白、阳性、阴性对照进行分析。
54.1.4.10.3间接免疫荧光鉴定在24孔板内培养单层vero细胞，pedv感染18h后，pbst洗3遍，冷甲醇固定10min，pbst洗三遍；分别加入单抗腹水pedv-n-3c8、阴性对照(pbs)，37℃水浴孵育1h，pbst洗3遍；再加入1:500稀释的fitc标记的羊抗鼠igg，37℃水浴孵育1h，用pbst洗去未结合的抗体，荧光显微镜下观察结果。
55.1.4.10.4western blot分析取纯化后rn蛋白进行sds-page电泳，转印至nc膜上，10％脱脂乳封闭后，分别以制备的单抗腹水、抗his标签单抗为一抗，羊抗鼠hrp为二抗，进行western-blot鉴定。
56.1.4.10.5酶标单克隆抗体的效价测定将制备的单克隆抗体进行hrp标记和纯化。将纯化后的酶标单克隆抗体无菌定量分装，1.0ml/管，-70℃以下保存。用间接elisa方法测定酶标单克隆抗体的抗体效价。
57.1.4.11pedv抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法(cleia)的建立
58.1.4.11.1最佳浓度的确定
59.以ph 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液将rn蛋白分别按1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml浓度稀释并包被化学发光板，分别将5份pedv阳性猪血清、5份pedv阴性猪血清与含hrp标记单抗的酶标单抗1:1混合后加入100μl于发光板中置37℃反应30min，pbst洗涤后加鲁米诺化学发光底物，化学发光免疫分析仪测定结果，以最大n/p化学发光值比值所对应的浓度确定为最佳包被浓度；将辣根过氧化物酶标记的抗rn蛋白单克隆抗体按1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000稀释，方法同上，确定最佳酶标单抗工作浓度。
60.1.4.11.2最佳酶标单抗稀释液的确定
61.分别含15％胎牛血清、1.5％酪蛋白、3％牛血清白蛋白(bsa)、1％胰酪胨的tris-cl作为酶标单抗稀释液，方法同1.4.11.1，以最大n/p化学发光值比值所对应的缓冲液作为最佳缓冲液。
62.1.4.11.3最佳反应时间的确定
63.待检血清和酶标单抗分别于37℃反应15min、30min、60min，作2组重复试验，加入底物后15～25℃下避光分别作用3分钟、5分钟、10分钟，每个时间点作2组重复，以最大n/p值所对应时间为待检血清与酶标单抗最佳反应时间及最佳底物作用时间。
64.1.4.11.4校准品的制备
65.采用经血清中和试验测定中和效价为1：29的pedv阳性血清作为校准品溯源血清，赋值为1000ncu/ml，用校准品稀释液对血清进行倍比稀释，测定稀释血清的发光值，以抗体剂量值为横坐标，发光值为纵坐标，运用elisacalc软件进行分析，通过四参数曲线拟合方法拟合出校准曲线。从曲线中选择出5个特征点，用校准品稀释液将标准阳性血清根据剂量
值按比例分别稀释，作为校准品2～校准品6，用校准品稀释液将spf猪血清1∶20倍稀释制备校准品1。根据校准品溯源血清检测值和校准品绘制的校准曲线回算抗体剂量值关系，标定合格后将校准品定量分装，-20℃以下保存备用。
66.1.4.11.5临界值的确定
67.以确定的最佳反应条件和试剂检测背景清晰的pedv疫苗临床试验的猪血清81份，用血清中和试验鉴定均为pedv抗体阳性；检测采集未经sva疫苗免疫的猪血清324份，用血清中和试验鉴定均为pedv抗体阴性。测定并根据标准曲线计算出抗体剂量值，以ncu/ml表示。采用spss 16.0软件对所有血清样本的抗体剂量值进行分析。使用非参数法构建roc曲线，并以约登(youden)指数(youden指数＝敏感性-(1-特异性))最大的点作为阴阳性判断的临界点，对应的抗体剂量值即为临界值。
68.1.4.11.6特异性试验
69.用建立的pedv抗体竞争cleia分别检测prrsv、csfv、prv、fmdv、tgev、pdcov、rv、大肠杆菌阳性血清阳性血清各2份，同时用pedv血清中和试验进行平行检测，验证建立方法的特异性。
70.1.4.11.7敏感性试验
71.将校准品溯源血清用酶标单抗稀释液按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048、1∶4096稀释，分别用建立的pedv抗体竞争cleia进行检测，同时以血清抗体中和试验进行鉴定，验证建立方法的敏感性。
72.1.4.11.8重复性试验
73.用3个批次pedv抗体竞争cleia试剂分别检测经血清抗体中和试验测定为pedv抗体阴性2份、弱阳性血清2份、强阳性血清2份，每份血清样品作5次重复检测，对结果进行统计学分析，计算批间变异系数(coefficient of variation,cv)，cv(％)＝(标准差/平均值)
×
100％。
74.1.4.11.9比对试验
75.分别采用建立的pedv抗体竞争cleia与血清中和试验分别对从不同猪场采集的120份猪血清进行检测，确定所建方法与中和试验之间的符合率。
76.2、结果
77.2.1重组穿梭质粒pfastbac-n的构建及鉴定用ecor i、sal i双酶切重组穿梭质粒pfastbac-n，结果可见4856bp和1348bp的条带，分别为pfastbachta载体和n基因，表明质粒构建成功(图1)。经基因测序表明目的序列与原序列完全一致。
78.2.2重组杆粒bacmid-n的鉴定以m13f/r通用引物对提取的重组杆粒bacmid-n进行pcr鉴定。结果可见3600bp的，均与目的大小相符，表明重组杆粒bacmid-n构建成功(图2)。
79.2.3重组杆状病毒rbv－n的获得用重组杆粒bacmid-n转染sf9细胞5d-6d后得到第1代重组杆状病毒，与未转染细胞(图3中的a)相比，sf9细胞出现变大、破裂、脱落死亡等典型病变(图3中的b)。表明重组杆状病毒rbv-n拯救成功。
80.2.4重组n蛋白的特异性鉴定
81.2.4.1间接elisa方法：用间接elisa方法测定，rn蛋白与pedv抗体阳性血清存在特异性反应，而与prrs、csfv、prv、fmdv、tgev、pdcov、rv阳性血清无特异性反应(表1)，表明rn蛋白特异性较好。
82.表1 rn蛋白elisa方法检测结果
[0083][0084][0085]
注：s/n值＝样品od值/阴性对照od值；s/n值＜2.1，样品应判定为抗体阴性；s/n值≥2.1，样品应判定为抗体阳性。
[0086]
2.4.2western-blot鉴定取纯化后rn、sf9细胞蛋白进行western-blot鉴定，可见rn蛋白泳道出现59kda大小条带，而对照sf9细胞未出现此条带，表明rn蛋白具有良好的反应原性(图4)。
[0087]
2.5单克隆抗体的筛选免疫的balb/c小鼠脾细胞和sp2/0骨髓瘤细胞的融合率为94％，选elisa阳性值最高的且同时与rn蛋白、pedv均有反应的孔，进行3次亚克隆筛选，获得1株能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为pedv-n-3c8。
[0088]
2.6单克隆抗体的鉴定
[0089]
2.6.1亚类鉴定鉴定结果显示pedv-n-3c8株属于igg1亚类，能稳定分泌抗体。
[0090]
2.6.2特异性鉴定所获得的单克隆抗体与pedv、rn蛋白能发生较强的特异性反应，而与sf9细胞蛋白包被板未发生非特异性反应(表2)，表明获得的单克隆抗体是针对pedv n蛋白抗原表位。
[0091]
表2单克隆抗体的elisa反应结果
[0092][0093]
注：s/n值＝样品od值/阴性对照od值；s/n值＜2.1，样品应判定为抗体阴性；s/n值≥2.1，样品应判定为抗体阳性。
[0094]
2.6.3间接免疫荧光(ifa)结果显示(图5)，单抗能与pedv感染的vero细胞发生反应，有较强的荧光信号，而pbs阴性对照无任何荧光，表明单抗是针对pedv的抗原表位。
[0095]
2.6.4western blot分析取纯化后rn蛋白进行sds-page电泳，以制备的单抗腹水为一抗可见59kda处有条带，而抗his标签单抗为一抗在此处没有条带，表明单克隆抗体pedv-n-3c8是针对rn蛋白的(图6)。
[0096]
2.6.5效价测定将酶标单克隆抗体从1∶1.6
×
103开始稀释，用间接elisa方法测定
抗体效价，当最大稀释度达到1∶1.024
×
105时，s/n值≥2.1，即酶标单克隆抗体的效价为1∶1.024
×
105，结果见表3。
[0097]
表3酶标单克隆抗体的效价测定结果
[0098][0099]
注：s/n值＝样品od值/阴性对照od值；s/n值＜2.1，样品应判定为抗体阴性；s/n值≥2.1，样品应判定为抗体阳性。
[0100]
2.7pedv抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法(cleia)的建立
[0101]
2.7.1最佳浓度的确定
[0102]
分别以1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml的浓度包被elisa板。酶结合液浓度分别做1:1000、1:2000、1:5000、1:10000四个浓度梯度。使用已知阴阳血清测定od值。结果见表4，当rn的包被浓度为0.2μg/ml、酶浓度为1:5000时，n/p值最大，可以满足实验要求，且od值范围符合预期结果。最终确定rn的包被浓度为0.2μg/ml、酶浓度为1:5000。
[0103]
表4 pedv抗体竞争cleia最佳浓度的确定
[0104][0105][0106]
2.7.2最佳酶标单抗稀释液的确定
[0107]
检测结果显示，含1％胰酪胨的酶标单抗稀释液有效提高了敏感性，n/p值最大，见表5，故将含1％胰酪胨的tris-cl溶液作为酶标单抗稀释液。
[0108]
表5酶标单抗稀释液的确定
[0109][0110]
2.7.3最佳反应时间的确定
[0111]
检测结果显示，第一步待检血清、酶标单抗与抗原在37℃条件下作用30min时，最后加入底物后作用5min，n/p值最大，见表6和表7，因此确定最佳作用时间为30min+5min。
[0112]
表6待检血清、酶标单抗与抗原的最佳反应时间
[0113][0114]
表7底物最佳作用时间
[0115][0116]
2.7.4校准品的制备
[0117]
采用经血清中和试验测定中和效价为1：29的pedv阳性血清作为校准品溯源血清，赋值为1000ncu/ml，用校准品稀释液对血清进行倍比稀释，测定稀释血清的发光值，以抗体剂量值为横坐标，发光值为纵坐标，运用elisacalc软件进行分析，通过四参数曲线拟合方法拟合出校准曲线。从曲线中选择出5个特征点，用校准品稀释液将标准阳性血清根据剂量值按比例分别稀释，作为校准品2～校准品6，用校准品稀释液将spf猪血清1∶20倍稀释制备校准品1。根据校准品溯源血清检测值和校准品绘制的校准曲线回算抗体剂量值关系，标定合格后将校准品定量分装，-20℃以下保存备用。
[0118]
将校准品溯源血清进行2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048倍稀释，绘制出校准品的四参数拟合曲线。根据曲线看出抗体剂量值≤200ncu/ml时发光值区分最为明显，因此以200ncu/ml为起点(校准品溯源血清稀释2倍)，依次配制不同抗体剂量值的血清样品，重复多次绘制四参数拟合曲线，当抗体剂量值在10ncu/ml、25ncu/ml、50ncu/ml、100ncu/ml和200ncu/ml时，所对应的坐标点重复性最好，且曲线的r2均＞0.999，见图7。配制三批次校准品，制备校准品抗体剂量值与理论抗体剂量值的偏差在5.0％以内，结果见表8。
[0119]
表8配制校准品理论抗体剂量值与实测剂量值比较
[0120][0121]
2.7.5临界值的确定
[0122]
利用spss 16.0软件对检测结果进行数据分析，以敏感性为纵坐标，1-特异性为横坐标，绘制roc曲线，见图8。计算每个临界值的youden指数(youden指数＝敏感性-(1-特异性))，youden指数最大为0.983，所对应抗体剂量值为15.1ncu/ml，见表9，仅显示部分。因此，将本方法的临界值确定为15，最终将本方法的判定标准定为：样本抗体剂量值≥15ncu/ml时，为pedv抗体阳性；样本抗体剂量值＜15ncu/ml时，为pedv抗体阴性。在此判定标准下，此临界值对应的敏感性为93.81％，特异性为98.85％。
[0123]
表9不同剂量值所对应的敏感性、特异性及youden指数
[0124][0125]
2.4.6特异性试验
[0126]
结果显示，见表10，用建立的pedv抗体竞争cleia分别检测prrsv、csfv、prv、fmdv、tgev、pdcov、rv、大肠杆菌阳性血清，均为阴性，无交叉反应，与血清中和试验结果一致。
[0127]
表10特异性试验结果
[0128][0129][0130]
注：血清中和试验判定结果为血清抗体效价＜1:22时为阴性，血清抗体效价≥1:23时为阳性。
[0131]
2.4.7敏感性试验
[0132]
建立的pedv竞争cleia与中和试验检测结果一致，均可检测到最大稀释倍数为1∶64的校准品溯源血清，结果见表11。
[0133]
表11敏感性试验结果
[0134][0135][0136]
注：血清中和试验判定结果为血清抗体效价＜1:22时为阴性，血清抗体效价≥1:23时为阳性。
[0137]
2.4.8重复性试验
[0138]
检测结果见表12，建立的sva竞争cleia分析内、分析间变异系数在2.84％～5.85％之间，小于10％；批间变异系数在3.85％～6.34％之间，小于10％。
[0139]
表12重复性试验结果(第一批次)
[0140][0141]
表13重复性试验结果(第二批次)
[0142][0143]
表14重复性试验结果(第三批次)
[0144][0145]
2.4.9保存期研究
[0146]
3套不同批次pedv竞争cleia试剂于2～8℃放置保存15个月，仍可检测到最大稀释倍数为1∶64稀释的阳性溯源血清，检测prrsv、csfv、prv、fmdv、tgev、pdcov、rv、大肠杆菌阳性血清，剂量值均小于15ncu/ml，无交叉反应。因此，将该方法的保存期确定为12个月。
[0147]
2.4.10比对试验
[0148]
检测结果显示，见表15，建立的pedv竞争cleia检测结果与中和试验阳性符合率为92.11％，阴性符合率为96.47％，总符合率为97.5％。
[0149]
表15 pedv竞争cleia检测方法与中和试验结果的比较
[0150][0151]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可
以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。