一种花粉多糖组分1及其分离方法和应用与流程

本发明属于植物提取物分离，具体涉及一种花粉多糖组分1及其分离方法和应用。

背景技术：

1、发明人之前的研究(专利cn 113133454b与专利cn113133455b)表明油菜花粉水提物可用于植物抗逆以及促进植物生长，其中包括了蔬菜或果树，例如娃娃菜、莴笋、生菜、上海青、小麦、辣椒、番茄、柑橘、猕猴桃、樱桃、梨、苹果等，同时，还对其中的成分进行了检测，含有糖类、蛋白质、氨基酸和脂类等多种成分。但具体活性成分还未见研究。

2、另外，文献“氨基酸与植物抗逆性关系的研究进展”(邢芳芳,高明夫,周传志,徐春英,范玲超.[j].黑龙江农业科学,2018(03):150-155)报道了氨基酸类物质也可用于植物抗逆。

3、在油菜花粉水提物中可能存在多种具有促进植物生长或抗逆作用物质的基础上，现目前，所属领域的技术人员无法得知哪种物质在促进植物生长或抗逆中起主导作用，因此必要对油菜花粉提取物进行进一步的研究。

技术实现思路

1、多糖是由多个单糖分子脱水缩合而成的一类结构复杂的糖类物质，结构单位之间以糖苷键相连接，常见的糖苷键有ɑ-1,3糖苷键、β-1,6糖苷键、β-1,4糖苷键、ɑ-1,4糖苷键和β-1,3糖苷键等。多糖广泛存在于动物、植物和微生物中，不同来源的多糖具有不同的生物活性。现有研究表明，植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖和降血脂等生物活性，又具有来源广、可降解、安全性高、易于修饰、环境亲和力高等特点，而被广泛应用于食品、医药、畜牧养殖及水产养殖等行业中。

2、同时，植物多糖是一类天然大分子聚合物，其结构较为复杂，目前对于花粉多糖的具体分子结构与其生理活性的构效关系研究较少，因此有必要对花粉多糖类化合物进行分离鉴定，为花粉多糖资源的未来开发研究提供可靠的理论和实验依据。

3、本发明对油菜花粉中的多糖进行了提取、分离和纯化，得到了一种新花粉多糖，经测试，该花粉多糖在植物促长和抗逆方向均具有一定的效果。

4、具体地，本发明提供一种花粉多糖组分1，其主要重复结构单元如下：

5、 

6、其中

7、r1为t-α-l-araf-(1→5)-α-l-araf-(1→

8、r2为t-β-d-galp-(1→6)-β-d-galp-(1→

9、r3为t-α-d-glcp-(1→4)-α-d-glcp-(1→。

10、在本发明的多糖主链中，基团r1，r2，r3连接在阿拉伯糖的5号位。

11、本发明中，ara代表阿拉伯糖；gal代表半乳糖；glc代表葡萄糖；f代表呋喃糖构型；p代表吡喃糖构型；t代表多糖分子末端(端基)。

12、其中，阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖摩尔含量比等于0.671：0.132：0.120。

13、本发明的花粉多糖中除上述主要重复结构单元外，还含有以下痕量单糖单元：岩藻糖、木糖和甘露糖。

14、其中，岩藻糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖摩尔含量比等于0.008：0.671：0.132：0.120：0.011：0.046。

15、本发明中，花粉多糖的平均分子量为20～30kda；

16、进一步地，花粉多糖的平均分子量为23～26kda；

17、本发明中，花粉多糖的平均分子量在24kda～25kda，例如24774.22da。

18、本发明的花粉多糖其红外光谱至少包括下列吸收峰之一或一种以上：3342cm-1、1641cm-1、1536cm-1、1440cm-1、1147cm-1、1103cm-1、1076cm-1、1311cm-1、1241cm-1、1027cm-1、894cm-1、873cm-1、873cm-1。

19、其中，3342m-1是o-h的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。1641cm-1处吸收峰归属于结晶水；1536cm-1处吸收峰归属于n-h变角振动；1440cm-1处、1147cm-1处、1103cm-1处、1076cm-1处吸收峰，归属于c-o伸缩振动；1311cm-1处、1241cm-1处、1027cm-1处吸收峰，归属于o-h变角振动；894cm-1处吸收峰，归属于吡喃环的β-端基差向异构的c-h变角振动；873cm-1处吸收峰，归属于吡喃环的端基差向异构c-h以外的赤道键的c-h变角振动。进一步地，本发明花粉多糖的红外光谱如图16所示。

20、本发明的目的还在于提供一种上述的花粉多糖的分离方法，包括以下内容：

21、(1)油菜花粉多糖提取物经大孔吸附树脂柱纯化，以水洗脱得到初步纯化的花粉多糖活性部位fr-1；

22、(2)通过离子交换层析柱，以水对花粉多糖活性部位fr-1进行洗脱，得到花粉多糖活性部位fr-1-1；

23、(3)采用凝胶层析柱对花粉多糖活性部位fr-1-1进一步纯化，其中碳酸氢铵水溶液作为洗脱液，得组分1，即本发明的花粉多糖。

24、上离子交换柱的花粉多糖活性部位fr-1，其形式可以是大孔树脂的原洗脱液，也可以是原洗脱液的浓缩液，又或者是原洗脱液浓缩干燥后的复溶液等等。

25、上凝胶层析柱的花粉多糖活性部位fr-1-1，其形式可以是离子交换柱的原洗脱液，也可以是原洗脱液的浓缩液，又或者是原洗脱液浓缩干燥后的复溶液等等。

26、本发明中所述浓缩干燥，所用方法包括但不限于：减压蒸发、常压蒸发、烘干、真空干燥、薄膜干燥、冻干等常规操作手段，这些手段可以单独使用，也可以联合使用。

27、步骤(1)所述油菜花粉多糖提取物是指通过常规方法获取的油菜花粉粗多糖。本发明所述常规方法包括但不限于水提以及水提后的初步纯化方式。

28、所述水提，包括但不限于加热提取、超声提取、微波提取等常规植物提取物提取方法。

29、同时，还可以根据不同情况，在提取前采用脱脂、脱色等方式进行除杂处理，例如采用脂溶性溶剂进行提取脱脂脱色，如乙醇、石油醚等。

30、所述水提后的初步纯化方式，包括但不限于醇沉、壳聚糖除杂等不同方式。

31、在纯化方法中，还可以根据不同情况，选择性加入除蛋白、脱色、除小分子等辅助手段，便于后续多糖的富集工艺。例如可以使用除蛋白试剂，如酚、三氯乙酸、鞣酸等等；可以使用吸附剂脱色，例如纤维素、硅藻土、活性炭等；可以使用透析等方法除去小分子。

32、在本发明的一些具体实施方案中，步骤(1)中所述油菜花粉多糖提取物是指油菜花粉水提醇沉后得到的花粉粗多糖。

33、本发明中，若选用水提醇沉法，则醇沉步骤中，在水提液(或水提液的浓缩液)中加入乙醇，直至乙醇浓度达到70-90％v/v，例如可以选择70％、71％、72％、73％、74％、75％......80％......85％......90％v/v等等。

34、在本发明的一些具体实施方案中，步骤(1)中所述油菜花粉多糖提取物是指油菜花粉加热水提，壳聚糖除杂的花粉粗多糖。

35、在本发明的一些具体实施方案中，油菜花粉可经超微粉碎处理，以便于多糖的提取。

36、在本发明的一些具体实施方案中，油菜花粉的花粉多糖提取液可经真空冷冻干燥制成花粉粗多糖固体。

37、在本发明的技术方案中，步骤(1)中所用大孔树脂柱为非极性柱。

38、本发明中，大孔树脂柱包括但不限于db-101大孔树脂柱、s-8大孔树脂柱，ab-8大孔树脂柱，hp-20大孔树脂柱；进一步，大孔树脂柱选自hp-20大孔树脂柱。

39、在本发明的一些实施例中，步骤(1)中初步纯化的花粉多糖活性部位fr-1可经透析、冷冻干燥处理得固体备用；步骤(2)中花粉多糖活性部位fr-1-1经透析、冷冻干燥处理得其固体备用；

40、本发明中，透析的截留分子量至少为3500da。

41、在本发明的技术方案中，步骤(2)中所用离子交换柱为阴离子交换柱，所述阴离子包括但不限于deae-纤维素、deae-琼脂糖凝胶、deae-葡萄糖凝胶等不同离子交换柱，进一步选自deae cellulose-52层析柱。

42、在本发明的技术方案中，步骤(3)中所用凝胶层析柱；所述凝胶层析柱包括但不限于葡聚糖凝胶(sephadexg)层析柱、聚丙烯酸凝胶toyopearlhw层析柱等不同凝胶层析柱；例如可以选自丙烯葡聚糖凝胶s-400hr层析柱、sephadexlh-20层析柱等；

43、在本发明的技术方案中，步骤(3)中，碳酸氢铵水溶液的浓度为0.1～0.3mol/l，优选0.2mol/l。

44、在本发明的一些具体实施方式中，将步骤(3)含有组分1的洗脱液经减压浓缩、透析(3500da)除盐、冷冻干燥，得到花粉多糖组分1。

45、在本发明的一些具体实施方式中，采用苯酚-硫酸法检测步骤(2)与步骤(3)中糖含量，检测其490nm处吸光值。

46、本发明还提供一种油菜花粉多糖活性部位fr-1，油菜花粉多糖提取物经大孔树脂、以水洗脱得到花粉多糖活性部位fr-1。

47、本发明中，所述大孔树脂柱为非极性柱；进一步选自db-101大孔树脂柱、s-8大孔树脂柱，ab-8大孔树脂柱，hp-20大孔树脂柱中的一种；进一步，大孔树脂柱选自hp-20大孔树脂柱。

48、在本发明的一些实施例中，经大孔树脂柱纯化的花粉多糖活性部位fr-1可经透析、冷冻干燥处理得其固体；

49、进一步地，透析的截留分子量至少为3500da的物质。

50、本发明还提供一种油菜花粉多糖活性部位fr-1-5，由如下方法得到：油菜花粉多糖提取物经大孔树脂纯化，再通过离子交换层析柱，以0～0.25mol/l氯化钠溶液进行洗脱得到活性部位fr-1-5。

51、本发明中所述离子交换层析柱为阴离子交换层析柱；进一步选自deae纤维素层析柱。

52、在本发明的一些实施例中，经大孔树脂柱纯化的花粉多糖活性部位fr-1-5可经透析、冷冻干燥处理得其固体；

53、进一步地，所述透析的截留分子量至少为3500da的物质。

54、在本发明的一些实施例中，所述油菜花粉多糖提取物是指油菜花粉经乙醇脱脂、加热水提、醇沉除杂的花粉粗多糖。

55、本发明还提供一种花粉多糖活性部位fr，由如下方法得到：油菜花粉经水提取，取上清液，浓缩，用无水乙醇醇沉得到活性部位fr。在醇沉后，若采用乙醚、丙酮等有机溶剂进行常规洗涤操作，洗涤后的产物仍然属于fr的范畴。

56、本发明，醇沉步骤中，在水提液(或水提液的浓缩液)中加入乙醇，直至乙醇浓度达到70-90％v/v，例如可以选择70％、71％、72％、73％、74％、75％......80％......85％......90％v/v等等。

57、本发明中，经历浓缩步骤时，其浓缩程度是本领域技术人员可以根据洗脱时加入的洗脱液的量以及产品的最终需求来确定的。

58、本发明中的多种提取物，可以为不同形态存在，例如固体、液体、混悬等等。可以根据实际生产、销售、使用等需求，作出常规的产品形态调整。

59、本发明的目的还在于花粉多糖组分1、花粉多糖活性部位fr、花粉多糖活性部位fr-1或花粉多糖活性部位fr-1-5在制备植物抗逆产品中的应用。

60、本发明所述植物抗逆，包括抗寒、抗旱、抗高温、耐盐碱等。

61、本发明中，使用时将含有花粉多糖的产品施于植物叶面或植物根部。

62、本发明中花粉多糖的产品制成溶液使用时，主要活性成分的浓度可以根据实际需要进行选择。

63、例如花粉多糖组分1使用时的浓度可以选自0.01ppm～500ppm；可以选自0.01ppm～100ppm；可以选自0.01ppm～50ppm；还可以选自0.03ppm，......0.05ppm，......0.1ppm，......0.2ppm，......0.5ppm，......1.0ppm，......3.0ppm，......5.0ppm，......10ppm，......20ppm，......30ppm等等。

64、例如花粉多糖活性部位fr使用时的浓度可以选自0.01ppm～500ppm；可以选自0.01ppm～100ppm；可以选自0.01ppm～50ppm；还可以选自0.03ppm，......0.05ppm，......0.1ppm，......0.2ppm，......0.5ppm，......1.0ppm，......3.0ppm，......5.0ppm，......10ppm，......20ppm，......30ppm等等。

65、例如花粉多糖活性部位fr-1使用时的浓度可以选自0.01ppm～500ppm；可以选自0.01ppm～100ppm；可以选自0.01ppm～50ppm；还可以选自0.03ppm，......0.05ppm，......0.1ppm，......0.2ppm，......0.5ppm，......1.0ppm，......3.0ppm，......5.0ppm，......10ppm，......20ppm，......30ppm等等。

66、例如花粉多糖活性部位fr-1-5使用时的浓度可以选自0.01ppm～500ppm；可以选自0.01ppm～100ppm；可以选自0.01ppm～50ppm；还可以选自0.03ppm，......0.05ppm，......0.1ppm，......0.2ppm，......0.5ppm，......1.0ppm，......3.0ppm，......5.0ppm，......10ppm，......20ppm，......30ppm等等。

67、本发明的目的还在于花粉多糖组分1、花粉多糖活性部位fr、花粉多糖活性部位fr-1或花粉多糖活性部位fr-1-5在制备促进植物生长产品中的应用。

68、本发明中所述植物包括但不限于经济作物、粮食作物，例如小白菜、娃娃菜、莴笋、生菜、上海青、小麦、辣椒、番茄、柑橘、猕猴桃、樱桃、梨、苹果、烟草等。

69、所述“经济作物”，种类繁多，包括但不限于纤维作物(如棉、麻等)、油料作物(如芝麻、花生等)、糖料作物(如甘蔗、甜菜等)、嗜好作物(烟草)、药用作物、染料作物、观赏作物、水果和其他经济作物等。

70、所述“粮食作物”，包括但不限于谷类作物(小麦，水稻，玉米)、薯类作物(包括甘薯、马铃薯等)及豆类作物(包括大豆、蚕豆、豌豆、绿豆等)等。

71、本发明还提供一种农用产品，所述产品的活性成分包括花粉多糖组分1、花粉多糖活性部位fr、花粉多糖活性部位fr-1或花粉多糖活性部位fr-1-5。

72、本发明中，可将直接花粉多糖组分1、花粉多糖活性部位fr、花粉多糖活性部位fr-1或花粉多糖活性部位fr-1-5作为单剂使用，为了使产品稳定、便于运输保存，也可加入辅料制成相应的剂型，辅料可以是本领域常规的辅料，例如，分散剂、润湿剂、粘结剂、乳化剂、稳定剂、溶剂、包埋剂等等。

73、另一方面，本发明所述花粉多糖组分1、花粉多糖活性部位fr、花粉多糖活性部位fr-1或花粉多糖活性部位fr-1-5可以作为增效剂与叶面肥、水溶肥、复合肥、农药等产品复合使用。

74、本发明中所述产品的剂型包括但不限于乳油、悬浮剂、可湿性粉剂、粉剂、粒剂、水剂、母液、母粉等常规农产品制剂。

75、本发明的有益效果在于：

76、本发明发现了一种新的多糖组分1并首次从油菜花粉中分离得到，该多糖可用于植物抗逆及促进植物生长。本发明还发现油菜花粉粗分离组分花粉多糖活性部位fr、花粉多糖活性部位fr-1或花粉多糖活性部位fr-1-5同样具有植物促长和抗逆作用。

77、本发明中所述“油菜”，为十字花科、芸薹属草本作物，常见的“油菜”包括但不限于白菜型油菜、甘蓝型油菜、黑芥型油菜、芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥等。本发明所述“花粉”取自上述“油菜”。