本发明属于生物,具体涉及一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类鰤诺卡氏菌口服疫苗的应用。
背景技术:
1、鰤诺卡氏菌(nocardia seriolae)是隶属于诺卡氏菌科(nocardiaceae)诺卡氏菌属(nocardia),为革兰氏阳性、兼性细胞内病原菌。该菌可引起以皮肤溃疡、出血和内脏器官形成结节为特征的在内的多种鱼类慢性肉芽肿疾病。大口黑鲈诺卡氏菌病的潜伏期长、发病率高、症状变化缓慢,无特效的可治疗药物,导致患病鲈鱼出现大量死亡,给加州鲈养殖业造成了巨大的经济损失。
2、大口黑鲈(micropterus salmoides),又名加州鲈,是重要的淡水养殖品种,有生长速度快且对环境适应强等优点。近年来,随着养殖规模不断增加,加州鲈病害问题日益严重,特别是诺卡氏菌类疾病,导致加州鲈大规模爆发性死亡,造成巨大的经济损失。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种大口黑鲈鰤诺卡氏菌融合蛋白,开发一种安全有效的大口黑鲈鰤诺卡氏菌口服疫苗,为大口黑鲈的健康养殖提供保障。
2、本发明所采取的技术方案是:
3、本发明的第一方面,提供一种加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因,所述基因序列如seq id no.1所示。
4、本发明的第二方面,提供本发明第一方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因的相关生物材料,所述相关生物材料为下述任一种:
5、(a1)含有所述抗原基因的表达盒;
6、(a2)含有所述抗原基因的重组载体;
7、(a3)含有(a1)所述表达盒的重组载体;
8、(a4)含有所述抗原基因的重组细胞;
9、(a5)含有(a1)所述表达盒的重组细胞;
10、(a6)含有(a2)所述重组载体的重组细胞;
11、(a7)含有(a3)所述重组载体的重组细胞。
12、本发明的第三方面,提供一种融合基因,所述融合基因包括本发明第一方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因和usp45tm8基因。
13、在本发明的一些实施方式中,所述融合基因还包括连接序列和/或标签序列。
14、在本发明的一些实施方式中,所述连接序列如seq id no.5所示;所述标签序列如seq id no.6所示。
15、在本发明的一些实施方式中,所述融合基因的序列如seq id no.2所示。
16、本发明的第四方面,提供本发明第三方面所述融合基因的相关生物材料,其特征在于,所述相关生物材料为下述任一种:
17、(b1)含有所述融合基因的表达盒;
18、(b2)含有所述融合基因的重组载体;
19、(b3)含有(b1)所述表达盒的重组载体;
20、(b4)含有所述融合基因的重组细胞;
21、(b5)含有(b1)所述表达盒的重组细胞;
22、(b6)含有(b2)所述重组载体的重组细胞;
23、(b7)含有(b3)所述重组载体的重组细胞。
24、本发明的一些实施方式中,所述重组细胞为重组乳酸乳球菌。
25、本发明的一些实施方式中,所述重组乳酸乳球菌为lactococcus lactis nz9000pnz8148-hp,已于2021年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为:中国.武汉.武汉大学,保藏编号为cctcc no:m 2021447。
26、本发明的第五方面,提供本发明第三方面所述的融合基因所编码的融合蛋白。
27、本发明的第六方面,提供本发明第一方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因或本发明第二方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因的相关生物材料或本发明第三方面所述的融合基因或本发明第四方面所述的融合基因的相关生物材料或本发明第五方面所述的融合蛋白在制备预防和/或治疗大口黑鲈鰤诺卡氏菌引起的疾病的产品中的应用。
28、在本发明的一些实施方式中,所述大口黑鲈鰤诺卡氏菌引起的疾病包括:鱼类慢性肉芽肿疾病。
29、在本发明的一些实施方式中,所述产品为药物,优选为疫苗。
30、在本发明的一些实施方式中,所述疫苗为口服疫苗。
31、本发明的第七方面,提供一种产品,所述产品中包含本发明第一方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因或本发明第二方面所述的加州鲈诺卡氏菌表面蛋白抗原基因的相关生物材料或本发明第三方面所述的融合基因或本发明第四方面所述的融合基因的相关生物材料或本发明第五方面所述的融合蛋白。
32、在本发明的一些实施方式中,所述产品还包括佐剂。
33、在本发明的一些实施方式中,所述产品为药物,优选为疫苗。
34、在本发明的一些实施方式中,所述疫苗为口服疫苗。
35、本发明的有益效果是:
36、申请人发现大口黑鲈鰤诺卡氏菌的低氧反应蛋白(hypoxic response protein,hp)是大口黑鲈鰤诺卡氏菌毒力的关键蛋白之一,也是开发大口黑鲈鰤诺卡氏菌疫苗的关键抗原蛋白。本发明对鰤诺卡氏菌hp抗原序列进行了优化在此基础上,将该序列与分子大小为78bp的usp45tm8短肽基因进行融合,通过乳酸乳球菌pnz8148表达载体高效表达鰤诺卡氏菌hp蛋白,制备l.lactis nz9000 pnz8148-usp45tm8-hp作为加州鲈口服疫苗(武汉大学保藏中心保藏号:m 2021447),并添加口服佐剂,通过饲料投喂免疫加州鲈鱼,并使用诺卡氏菌进行感染评价加州鲈疫苗的免疫保护效果,同时检测血液中抗体滴度的变化情况,以及荧光定量测定igm抗体的变化情况,发现其可以高效用于诺卡氏菌的防治。
37、本发明的大口黑鲈鰤诺卡氏菌乳酸菌口服疫苗,使用了乳酸菌作为载体表达,与其它微生物载体表达的口服疫苗,具有以下明显的优势:第一,本研究中使用的乳酸菌表达载体是食品级的安全微生物,不存在其它弱毒疫苗、减毒活疫苗等隐藏的毒力返强的危险,也不存在其它类似芽孢杆菌表达系统中,芽孢杆菌对鱼体和人体的潜在危害。第二,本研究中外源蛋白在乳酸菌中表达后无需分离纯化,能降低疫苗生产的成本,比大肠杆菌等表达后需要纯化的疫苗成本低。第三,乳酸菌已证实在黏膜免疫中发挥免疫增强效应,能增强疫苗的免疫效果。第四,本研究中加州鲈口服疫苗非常适合于加州鲈鱼苗的养殖实践应用,因为鱼苗尺寸太小,难以进行疫苗注射免疫。第五,与加州鲈注射免疫相比,本研究中加州鲈口服疫苗能够极大地减少疫苗免疫的工作量和劳动力成本,提高养殖户使用疫苗的便利程度,而且也能减少鱼体应激和注射部位的不良反应。第六,与加州鲈浸泡免疫相比,浸泡免疫这种方式需要加强免疫,但是在养殖过程中很难把全部鱼从池塘中捞起来再次浸泡免疫(捞网会增加鱼的应激导致死亡),而本研究中口服疫苗可以每天和佐剂、饲料一起搅拌后投喂加州鲈鱼,不需要全部鱼捞网,且多次投喂增强免疫,与浸泡免疫相比,具有较好的免疫效果和操作实用性。第七,为避免为胃的酸性环境等破坏,减少肠道中疫苗剂量和免疫原性,本发明使用了与essai gr 01pr佐剂进行乳化从而包裹保护住口服疫苗的方法,使应用更加方便,可长期保存,也可现配现用。
38、相较于注射免疫的免疫方式,口服疫苗免疫使用更为方便,具有不受养殖时间、地点和免疫鱼的大小的限制,对鱼体无损伤、避免产生应激等优点,而且特别适合大口黑鲈这种鱼类使用。乳酸菌是人、动物和鱼的肠道微生物组成成分,为普遍公认的安全菌株,应用于食品工业中,作为表达系统的宿主菌相比其他微生物有天然优势。
39、本发明以人和动物无致病性且被公认为安全的食品级微生物——乳酸乳球菌作为宿主菌,基于该重组乳酸乳球菌制备的大口黑鲈鰤诺卡氏菌口服疫苗,无论对于加州鲈还是加州鲈的消费者——人类来说都是安全的。而且,基于该重组乳酸乳球菌制备的口服疫苗制备过程简单,仅需经过简单的菌培养和菌体分离、重悬操作即可得到有效的口服疫苗,通过添加口服佐剂并通过饲料投喂免疫加州鲈,这非常适合于加州鲈鱼苗和成鱼的养殖实践应用,能够极大地减少疫苗免疫的工作量,提高养殖户使用疫苗的便利程度。