一种重组人生长激素纯化工艺的制作方法

1.本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种重组人生长激素纯化工艺。


背景技术：

2.人生长激素(human growth hormone，hgh)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能。含有191个氨基酸残基，分子量为22kda左右。
3.重组人生长激素系将含人生长激素(rhgh)基因的重组质粒转化大肠杆菌，使其高效表达人生长激素，经发酵、离心、裂解、纯化，制剂制成。
4.大肠杆菌分泌型表达是一种最成熟和最稳定的生长激素生产技术，多年的临床应用表明，采用该技术生产的产品活性高，副作用小，是一种安全、有效的生长激素。
5.重组人生长激素生产的生产企业，绝大多数采用传统的菌体裂解液的离心方式，台式离心机进行分离，在小规模的生产条件下完全可行，如果生产规模扩大，台式离心机的不足之处就越发明显，主要体现在设备投入大，离心时间长，生产效率低。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种重组人生长激素纯化工艺本发明的技术方案为：
7.一种重组人生长激素纯化工艺，包括如下步骤：
8.s1:将发酵菌体12kg按照1：8的比例加入10mm tris-hcl-edta ph8.0裂解液96l左右，搅拌转速100rpm，裂解温度控制在4℃，裂解1.5小时；
9.s2：采用高速管式离心机对s1样品进行离心，连续流离心转速12000-16000rpm，上样流速1.5-2l/min，温度4℃，离心时间为15min～30min；
10.s3：超滤膜纯化工艺对重组人生长激素蛋白进行提纯，应用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜包，连续循环超滤，将超滤膜包安装到超滤夹具上，将含盐蛋白样品10l装入的不锈钢桶，将超滤器的进口管路插入液面下，打开泵，调整泵的流速，控制出口流速为1.2l/min，边超滤边向蛋白液中加入10mm tris-hcl-1mm edta进行稀释，监测电导率，当电导率达到0.8ms/cm超滤结束。
11.优选的是，所述离心时间为30min。
12.优选的是，所述tris-hcl-edta的ph为8.0。
13.优选的是，所述连续流离心转速16000rpm。
14.优选的是，所述s2中上样流速2l/min。
15.与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
16.1、本工艺与原工艺相比，重组人生长激素蛋白收率基本一致，时间节约60％。
17.2、本工艺从生产效率、成本考虑，比原工艺节约成本，更适于生产规模。
附图说明
18.此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。
19.在附图中：
20.图1、原工艺、新工艺中离心上清液凝胶电泳对比图；
21.图2、原工艺、新工艺脱盐工艺凝胶电泳对比图；
22.图3、deae中e方案层析图；
23.图4、deae中f方案层析图；
24.图5、e方案hplc图；
25.图6、f方案hplc图。
26.图7、新旧工艺离心效率、超滤效率对比图。
27.附图说明：
28.图1中从左到右泳道：标准品、台式离心上清(原工艺)、连续离心上清(新工艺)；
29.图2中从左到右泳道：标准品、g-25脱盐(原工艺)、超滤脱盐(新工艺)。
具体实施方式
30.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
32.实施例
33.裂解离心实验：将发酵菌体12kg按照1：8的比例加入10mm tris-hcl edta ph8.0裂解液96l左右，搅拌转速100rpm，裂解温度控制在4℃，裂解1.5小时。
34.如图1所示，将裂解液等分成a组和b组，分别用台式离心机离心(原工艺)，离心条件4℃，10000rpm，弃沉淀取上清(命名为a组)；用连续流离心机离心(本发明新工艺)，离心条件4℃，进样流速2l/min，弃沉淀取上清(命名为b组)。
35.蛋白含量检测
36.将菌体a，b初步提取的上清液做蛋白含量的检测，方法为紫外吸收法，c＝(1.45
×
od280-0.74
×
od260)
×
1.23
×
稀释倍数。测量值如下表：
37.表1样品a和b蛋白含量
38.39.结果分析：根据实验a、b离心后样品浓度分析，利用台式离心机和连续流离心机的分离效果相同，蛋白回收率基本一致，两种离心方法对蛋白含量没有影响。
40.如图2所示，样品盐析：取a样品裂解液离心上清，按照45％的饱和度加入(nh4)2so4，充分搅拌后静置盐析2小时，用台式离心机离心，离心条件4℃，10000rpm，收取沉淀，沉淀用10mm tris-hcl-1mm edta(ph8.0)溶解，溶解后蛋白液分成c、d两份，别按照下述方法进行操作。
41.原工艺：020g-25层析柱脱盐，用10mm tris-hcl-1mm edta(ph8.0)缓冲液平衡2倍柱床体积，上样c样品，用10mm tris-hcl-1mm edta(ph8.0)洗脱，洗脱流速为80cm/h，根据紫外检测器的示数接收样品，取样做电泳，含量测定，命名为样品c。
42.新工艺：超滤膜脱盐：将10000分子量的超滤膜安装到超滤器上，用注射用水冲洗到中性。将蛋白样品d装入不锈钢桶，将超滤器的进口管路插入液面下，打开泵，调整泵的流速，控制出口流速为1.2l/min，边超滤边向蛋白液中加入10mm tris-hcl-1mm edta(ph8.0)进行稀释，监测电导率，当电导率达到0.8ms/cm时停止超滤，取样做电泳，含量测定，命名为样品d。
43.含量检测表
44.表2样品c和d含量
45.稀释倍数od280od260c(mg/ml)体积(l)蛋白量gc410.4980.42920.44.693.8d410.5560.48122.74.195.3
46.结果分析：从样品c和样d的含量测定结果分析，g-25脱盐(原工艺)和超滤膜脱盐(新工艺)的蛋白收率基本一致，没有大的差异，电泳结果也没有差异；但二者间的操作时间有较大差异，超滤用时60分钟，g-25脱盐用时150分钟。所以，从生产效率、人员成本考虑，用超滤脱盐比g-25脱盐节约成本，更适于生产规模。
47.如图3、4所示，deae层析工序再确认。
48.e原工艺流程：裂解
→
台式离心
→
盐析
→
g-25层析脱盐
→
deae层析
49.f发明工艺流程：裂解
→
连续流离心
→
盐析
→
超滤膜脱盐
→
deae层析
50.将a组样品和b组样品分别按照下述e、f工艺流程进行纯化，进一步比较纯化过程和结果。deae纯化流程：将脱盐后获得的蛋白液按照80cm/hr的线性流速上样，上样后用0.05mol/lnacl和0.08mol/lnacl溶液洗脱，根据紫外检测器的示数分段接收蛋白样品，取样检测电泳、高效液相色谱法检测蛋白纯度。
51.deae层析下样
52.由表3、4、5的数据可知，从样品下样e和f工艺方案蛋白收率基本一致，蛋白纯度也没有差异。
53.表3deae洗脱样品含量和纯度
54.样品蛋白含量(紫外吸收法)蛋白纯度(高效液相色谱法)e83.2g94.05％f82.8g94.15％
55.表4样品f(新工艺制备)高效液相测定结果
[0056][0057][0058]
表5样品e(原工艺制备)高效液相测定结果
[0059][0060]
本发明提供的重组人生长激素的纯化工艺中，简化了纯化路线，提高收率，从而降低生产成本。
[0061]
新工艺中连续流分离技术采用高速管式离心机，离心转速16000rpm，进料量2l/min，最大载量6kg，按照裂解菌液1kg/l，可离心30min，离心启动时间2min，离心停止时间4min，离心总量为60l，离心总时间为36min；传统生产工艺采用台式机离心，离心转速10000rpm，最大载量仅为6l，需要10轮次才能完成60l裂解菌液，再加上每次离心机启停时间6min，离心总时间为360min，是连续流离心用时的10倍。
[0062]
本发明提供的超滤脱盐技术：采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜包，重组人生长激素的分子量为22125道尔顿，盐析用的硫酸铵分子量为132)，将超滤膜包安装到超滤夹具上，将含盐蛋白样品10l装入的不锈钢桶，将超滤器的进口管路插入液面下，打开泵，调整泵的流速，控制出口流速为1.2l/min，边超滤边向蛋白液中加入10mm tris-hcl-1mm edta(ph8.0)进行稀释，监测电导率，当电导率达到0.8ms/cm超滤结束。
[0063]
如图7所示，从样品a(原工艺)和样品b(本发明提供工艺)的含量测定结果分析，超滤脱盐(本发明提供工艺)和g-25脱盐(原工艺)的蛋白收率基本一致，电泳结果也没有差异，但二者间的操作时间有较大差异，超滤脱盐(本发明提供工艺)用时60分钟，g-25脱盐(原工艺)用时150分钟，其中平衡用时60分钟，脱盐用时30分钟，后处理60分钟。超滤脱盐(本发明提供工艺)用时只是g-25脱盐(原工艺)用时40％。处理10l含盐蛋白样品，只需1块膜包市场价格8000元人民币，而g-25脱盐(原工艺)介质需要量为50l，市场价格50万人民币。超滤脱盐(本发明提供工艺)成本仅为g-25层析成本的1.6％。从生产效率、成本考虑，用超滤脱盐比g-25脱盐节约成本，更适于生产规模。
[0064]
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。