一种链霉菌生防菌株及其应用

1.本发明属于生物技术的微生物领域，具体涉及一种高效防治水稻稻瘟病的链霉菌（streptomycessp.qjk-30）生防菌株及其应用。


背景技术：

2.稻瘟病是一种毁灭性的水稻真菌病害，每年造成水稻产量损失10％-30％，严重时产量损失可达到50％，甚至绝收，全世界每年因稻瘟病损失的水稻足以养活6000万人。稻瘟病在水稻3-4叶期、分蘖盛期和始穗期容易发生。病原为稻瘟菌（magnaportheoryzae），生理小种繁多，高度可变，且受地理和气候影响影响较大，因而治理难度较大。
3.目前，水稻稻瘟病的防治方法主要包括：抗病品种选育与利用、农业栽培管理以及化学农药施用。抗病品种选育难度大，周期长。传统的农业在栽培措施防治稻瘟病，需要大量的人力物力，而且为了追求水稻的高产，采用了高产、多蘖良种以及推广抛秧、高密度、施用高氮肥的栽培技术，为病原菌创造了适宜的生长环境，致使农业栽培措施防治困难重重。化学农药高残留，对人畜有害，污染环境，具有环境风险，且长期使用导致抗药性。利用拮抗微生物防治植物病害，因选择性好、易降解和对环境友好等特点，在植物病害绿色防控方面越来越受到重视。研究表明，根际有益微生物对植物具有较好的亲和性，施用后易在植物体表或体内存活、定殖，防治效果持久稳定。虽然目前已发现了一些对稻瘟病菌的拮抗菌株或潜在的生防菌株，如假单胞菌（pseudomonassp.）、芽孢杆菌（bacillussp.）和某些链霉菌（streptomycessp.），但不同的拮抗微生物作用机理及使用方法不同。不同的生产应用需求不同的生防菌株，因此筛选更多更有效的生防菌非常必要。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种链霉菌（streptomycessp.qjk-30）生防菌株，可以用作生物农药，防治水稻稻瘟病。
5.本发明的链霉菌（streptomycessp.qjk-30）是从水稻根际土壤中采用土壤连续梯度稀释法，并结合室内对峙试验分离筛选获得。该链霉菌保藏在中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏单位简称为cctcc，保藏编号为cctccno：m2019376，保藏日期为2019年5月20日。其具有以下的微生物学特性：革兰氏阳性菌，孢子链呈紧密的螺旋形，液化明胶，牛奶胨化阳性，接触酶阳性，氧化酶阳性，酯酶阳性，淀粉水解阳性，纤维素水解阴性，不产生h2s；能利用d-葡萄糖、d-果糖、蔗糖、蜜二糖、d-木糖、d-棉子糖、l-鼠李糖等碳源，不能利用甘油、肌醇、l-树胶醛糖、d-甘露醇、d-半乳糖和α-乳糖；氮源利用广泛（除d-丝氨酸和l-精氨酸不能利用以外）。在na培养基上培养7d后，菌落圆滑，基内菌丝体黄褐的橄榄色，气生菌丝体丰富，白色，无可溶性色素。在nb液体培养基中培养3d，发酵液呈金黄色，澄清透明，菌体生长旺盛，菌球细小。
6.本发明的链霉菌（streptomycessp.qjk-30）的培养方法（或繁殖方法）、检测存活性条件：（1）营养琼脂（na）培养基，10g蛋白胨，5g氯化钠，5g牛肉膏，15g琼脂粉，1l蒸
馏水，ph 7.2-7.4，28℃下培养。实验室液体培养采用营养肉汤（nb）培养基。（2）大量发酵培养基为小米培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨3 g、2.5 g
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nacl、caco32 g
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，小米10g，蒸馏水1000 ml，ph值7.2-7.4
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。
7.该微生物制剂可以作为生物农药，防治水稻稻瘟病，防治效果可达70.9%。
8.本发明的有益效果：（1）本发明的链霉菌qjk-30为植物根际有益放线菌，能在植物体表和体内定殖，防治效果持久稳定。
9.（2）本发明的链霉菌qjk-30对环境友好。
10.（3）本发明的链霉菌qjk-30对稻瘟病的防治效果显著。
11.（4）本发明的链霉菌qjk-30培养条件简单，易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用潜力。
12.附图说明：图1 本发明实施例的链霉菌（streptomyces sp. qjk-30）在高氏一号培养基上的单菌落形态；图2本发明实施例的链霉菌（streptomyces sp. qjk-30）的系统进化树（基于16s rdna序列）；图3 本发明实施例的链霉菌（streptomyces sp. qjk-30）对稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用。
13.具体实施方式：下面结合具体实验实例及附图对本发明作进一步详细的描述。
14.实施例1：链霉菌qjk-30的分离筛选。
15.本发明的链霉菌，其属名为streptomyces，种名为streptomyces sp.，株名为qjk-30，从湖南省娄底市娄星区水稻种植区水稻根际土壤中分离，通过土壤连续梯度稀释法和平板对峙试验筛选获得，所述筛选方法属于本领域常规实验方法。
16.具体方法及过程描述如下：取根际土样（距土表层约10 cm深）1 g于99 ml无菌水中制成10-2
的土壤悬液，28℃，180 rpm摇瓶30 min，静置30 min后取上清液，连续梯度稀释后，涂布在高氏一号培养基平板上，置于28℃培养。挑取单菌落，在高氏一号培养基平板上进行划线培养，获得一株链霉菌，编号为qjk-30。
17.所述高氏一号培养基配方为：20 g可溶性淀粉，1 g kno3，0.5 g nacl，0.5 g k2hpo4·
3h2o，0.5 g mgso4·
7h2o，0.01 g feso4·
7h2o，16 g琼脂，蒸馏水1000 ml，ph 7.4-7.6。
18.实施例2：链霉菌（streptomyces sp. qjk-30）的鉴定1、形态学鉴定qjk-30菌株在高氏一号培养基上28℃恒温培养7d后，菌落圆形，质地紧致，气生菌丝白色，如图1显示。
19.2、生理生化鉴定qjk-30菌株革兰氏染色、氧化酶、接触酶、酯酶、脲酶和硝酸盐还原试验阳性；甲基红试验、v-p试验和吲哚产生试验阴性，不产生h2s；能液化明胶、使牛奶胨化、水解酪素、水解淀粉、利用柠檬酸盐，不能水解纤维素，如表1所示。
20.表1 链霉菌（streptomyces sp. qjk-30）的生理生化特性革兰氏染色+纤维素分解-糖发酵能力不产酸硝酸盐还原+明胶液化+氧化酶+牛奶胨化+接触酶+淀粉水解+mr试验-酯酶+v-p试验-吲哚产生-h2s产生-柠檬酸盐利用+尿素酶+酪素水解+
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3、分子鉴定取上述qjk-30菌株单菌落在高氏一号液体培养基中振荡培养5d （28℃，150 rpm），12000 rpm离心1 min，弃上清液，收集菌体。采用细菌基因组dna提取试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）按说明书进行操作。根据原核微生物16s rdna通用引物27f（5'-agagtttgatcctggctcag-3'）和1492r（5'-ggttaccttgttacgactt-3'），以qjk-30菌株的基因组dna为模板进行pcr扩增。100 μl pcr 反应体系：10
×
pcr缓冲液10 μl（含 mgcl2），10 mmol/l dntp 2 μl，10 μmol/l 27f引物 5 μl，10 μmol/l 1492r引物 5 μl ，5 μl模板dna (200 ng)，2.5u taq聚合酶，加双蒸水至终体积混匀后，在pcr仪上进行扩增：95℃变性4 min后，进入 pcr循环，每个循环为94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环；然后72℃延伸7min。用1％琼脂糖凝胶电泳（1%为琼脂糖的质量百分数）检测分析pcr扩增结果。应用回收试剂盒将 pcr产物回收，送往生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。对测序结果进行拼接处理，得到qjk-30菌株的16s rrna基因序列，长度为1402bp，ncbi（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）登录号为mk791670。
21.以mycobacterium. tuberculosis的16s rrna序列为外群，构建系统发育树，结果显示，qjk-30菌株与模式菌株streptomyces albospinus nbrc 13848(t)、streptomyces kasugaensis bcrc 12349(t)、streptomyces cellulofavus nrrc b-2493(t)处于同一小的分枝下，结合菌体形态、菌落特征和生理生化特征，初步鉴定为链霉菌属。
22.实施例3：链霉菌qjk-30对稻瘟病菌的体外抑菌活性测定实验。
23.以稻瘟病r01-1菌株（由本技术人实验室保存）为供试菌，采用平板对峙法测定。将qjk-30菌株和稻瘟病菌r01-1菌株重新活化，用无菌打孔器（7 mm）打孔，用无菌镊子夹取稻瘟病菌r01-1琼脂块置于pda平板中央，距离平板中心3 cm处放置qjk-30菌株琼脂块，以接种无菌琼脂块作对照，28℃培养至病原菌长满整个平板，观察抑菌效果并计算抑菌率。
24.抑菌率（%）=（rp-rt）/rp
×
100%其中，rp表示对照组菌丝生长半径，rt表示处理组菌丝生长半径（靠拮抗菌一侧），菌丝生长半径按测量平均值减去菌饼半径（3.5 mm）计算。
25.所述pda培养基配方为：200 g土豆，20 g葡萄糖，16 g琼脂，1000 ml蒸馏水，自然ph。
26.如图3所示，链霉菌qjk-30对稻瘟病菌r01-1菌株的菌丝生长有显著的抑制作用，抑制率为78.8%。
27.实施例4：链霉菌qjk-30防治稻瘟病的田间试验。
28.田间试验地点在湖南省湘乡市月山镇金坪村进行，该地点常年自然发生稻瘟病。水稻品种为杂交中稻隆两优华占。将田块分为4
×
5 m的小区，随机区组试验，秧苗移栽后20d和40d，对稻苗喷雾，分4种处理，3次重复：（1）清水对照，750l/ha；（2）链霉菌qjk-30发酵悬液（1
×
108cfu/ml），750l/ha；（3）三环唑（75%可湿性粉剂），施用量300 g/ha，兑水750l/ha。在第二次喷雾处理后40d，按稻瘟病测报调查规范（gb/t 15790-1995）计算防治效果（防效）。病情指数＝σ[各级病叶数
×
各级相对病级值]/[调查总叶数]
×
最高病级值。防效（%）＝（对照病情指数―处理病情指数）/对照病情指数
×
100。
[0029]
试验结果表明，链霉菌qjk-30菌株对稻瘟病的防效达70.9%，与三环唑的防效（72.4%）无显著差异（p＞0.05）（表2）。
[0030]
表2 链霉菌qjk-30对稻瘟菌的田间防效处理病情指数防效(%)对照13.4-qjk-303.970.9三环唑3.772.4