一种高产乙酸乙酯费比恩毕赤酵母在清香型小曲白酒中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体是涉及一种高产乙酸乙酯费比恩毕赤酵母及其在清香型小曲白酒中的应用。


背景技术：

2.毕赤酵母属中一些酵母种类是白酒酿造中的优势微生物，存在于整个白酒酿造过程中，其代谢的各种酯类物质丰富和增强了白酒风味，在酿酒行业有极大的研究价值和应用潜力。费比恩毕赤酵母(pichia fabianii)，又称费比恩塞伯林德纳氏酵母(cyberlindnera fabianii)，为产酯酵母，是黄酒发酵中的优势菌株，对黄酒风味产生显著性影响。赵龙飞等(食品研究与开发，2017)认为费比恩毕赤酵母对白酒香型起着重要作用。中国专利申请cn201711435833.0公开了一种产香酵母和酿酒酵母混合发酵的啤酒的制备方法，费比恩毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵改善了啤酒寡淡风味，赋予了啤酒浓郁的醇、酯香味，提高了挥发性风味物质含量，发酵所得啤酒品质优良，且酯香浓郁，风味协调，酒体醇厚。中国专利申请cn202110453573.x公开了一种产β-d-葡萄糖苷酶的费比恩毕赤酵母及其应用，该菌株产生的β-d-葡萄糖苷酶具有良好的热稳定性、ph稳定性、乙醇耐受性，利用该菌株进行人参和虎杖的发酵，能够在发酵过程中将人参皂苷转化为稀有人参皂苷，将虎杖苷转化为白藜芦醇，实现发酵液功效的提升。姚粟等(食品发酵与工业，20222)指出费比恩毕赤酵母还存在于腐乳后发酵过程中，产蛋白酶、淀粉酶、麦芽糖酶等生物酶，还能产生烷基苯酚、4-乙基愈创木酚和乙醇等香气物质。
3.随着食品生物技术的发展，越来越多的功能微生物正在改变酿酒方式，酿酒小曲中功能微生物的研究与开发具有很好的应用前景。乙酸乙酯是清香型小曲白酒的主体呈香物质，但目前清香型小曲白酒中对乙酸乙酯含量仍有较大的提升空间。毕赤酵母中的一些种类如库德里阿兹威毕赤酵母、异常毕赤酵母、发酵毕赤酵母等是清香型小曲白酒中的优势菌株，对白酒风味起着重要影响，但费比恩毕赤酵母在清香型小曲白酒中的研究鲜有报道，该菌株对白酒酒质和风味影响如何不可得知，因此，有必要对费比恩毕赤酵母开展功能性研究，特别是其在酿造中产生乙酸乙酯的能力，并将其应用于清香型小曲白酒中，以期改善小曲白酒品质，进一步丰富小曲中的功能菌。


技术实现要素：

4.本发明的发明目的之一在于提供一种新的费比恩毕赤酵母菌株费比恩毕赤酵母y10(pichia fabianii)，其具有较高的产乙酸乙酯能力，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m2022527，保藏日期是2022年4月29日，保藏单位地址为中国武汉，武汉大学。
5.本发明公开的费比恩毕赤酵母y10菌株从酒曲中分离经筛选获得，保藏于实验室菌种库中。该菌株有如下特征：
6.费比恩毕赤酵母y10在ypd平板上培养2d的菌落形态特征是：乳白色奶酪状，表面光滑微有突起，反光，边缘波浪状。在ypd液体培养基摇床培养24h的显微形态特征是：细胞呈圆形或椭圆形，出芽增殖。
7.本发明涉及的高产乙酸乙酯费比恩毕赤酵母(pichia fabianii)y10是按照如下方法获得的：
8.以实验室菌种库中挑选的45株不同种毕赤酵母作为高产乙酸乙酯微生物筛选来源。首先通过高粱汁静置发酵7d，发酵结束后测定发酵液中乙酸乙酯含量，筛选出产乙酸乙酯较高酵母菌株。然后将其与桂花曲按比例配成混合曲，以纯桂花曲作为对照曲，进行高粱发酵，蒸馏取酒后比较酒率、乙酸乙酯及其他主要质量指标。
9.本发明还公开了费比恩毕赤酵母的酿酒酒曲在清香型小曲原酒生产中的应用。所述高产乙酸乙酯费比恩毕赤酵母与桂花曲混合后进行发酵酿造。
10.本发明还公开了一种微生物菌剂，包含保藏编号为cctcc no:m2022527高产乙酸乙酯的费比恩毕赤酵母。所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
11.本发明还公开了一种清香型小曲白酒，其由包含保藏编号为cctcc no:m2022527的高产乙酸乙酯的费比恩毕赤酵母的微生物菌剂酿造而成。
12.与现有技术相比，本发明具有如下有效效益：
13.本发明的高产乙酸乙酯的费比恩毕赤酵母，可提升清香型小曲白酒中乙酸乙酯含量55％，明显提升了白酒质量。本费比恩毕赤酵母是从酒曲中分离出来，可用于白酒生产，为提升小曲白酒品质提供了新的功能菌株。
14.本发明的费比恩毕赤酵母(pichia fabianii)y10保藏日期为2022年4月29日，保藏编号为cctcc no:m2022527。保藏单位名称为中国典型培养物中心(cctcc)，地址为为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山中国典型培养物保藏中心，邮编：430072。
附图说明
15.图1是y10酵母菌落宏观形态图；
16.图2是筛选酵母在不同温度下的生长情况；
17.图3是筛选酵母在不同乙醇浓度下的生长情况；
18.图4是筛选酵母在不同葡萄糖浓度下的生长情况；
19.图5是筛选酵母在不同nacl浓度下的生长情况；
20.图6是筛选酵母在不同ph下的生长情况；
具体实施方式
21.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。
22.实施例1
23.1、高产乙酸乙酯毕赤酵母菌株筛选
24.1.1材料：
25.劲牌有限公司微生物研究室菌种库中挑选的45株毕赤酵母
26.1.2培养基制备：
27.①
ypd液体培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，ph自然。
28.②
ypd琼脂培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，琼脂粉20g/l，ph自然。
29.③
高粱汁培养基：1000g高粱磨粉，加入5l温水，加入5g糖化酶、5gα-淀粉酶，搅拌后放入60℃烘箱中保温30min，后于105℃，30min高压蒸煮，待冷却至60℃，将团块捏碎，加入5g糖化酶、5gβ-淀粉酶，搅拌均匀放入60℃烘箱中糖化24h，过滤得滤液，测定糖度，冷冻保藏备用。
30.1.3酵母菌株活化
31.取甘油保藏管中100μl菌液移入到10ml ypd液体管中，于30℃，150rpm/min摇床中培养24h，用接种环沾取培养液在ypd平板上进行划线分离，30℃倒置培养48h后，取一环单菌落再接种于ypd液体培养基中，于30℃，150rpm/min摇床中培养24h得种子液，放冰箱冷藏备用。
32.1.4产酯菌株筛选
33.将高粱汁培养基加水调节糖度为bx10，分装50ml至250ml锥形瓶中，121℃灭菌20min。取活化后的种子液按1％(v/v)的接种量接入培养基中，装上发酵栓，称重，精确至0.01g，于30℃静置发酵7d。发酵结束后取5ml发酵液，8000rmp离心5min，取上清液，过0.45μm滤膜，过滤好的发酵上清液进行气相色谱分析。挑选乙酸乙酯含量较高的菌株进行下一步固态发酵验证。
34.气相色谱结果显示菌种库中挑选的45株毕赤酵母经过发酵产酯初筛，y87、y42、y14和y10具有较高的乙酸乙酯产量，分别为2.81g/l、2.67g/l、1.00g/l、0.52g/l。
35.2、高产乙酸乙酯菌株发酵验证
36.按照如下方法进行：
37.(1)微生物纯种菌剂制备
38.按照麸皮1(以1计)，称取5
‰
硫酸铵，60％葡萄糖，加水60％，搅拌均匀，灭菌备用；将保藏编号为cctcc no:m2022527的费比恩毕赤酵母(pichia fabianii)y10种子液接入麸皮培养基中，30℃静置培养48h，干燥后制成y10麸皮纯种菌剂。
39.(2)费比恩毕赤酵母混合曲配备
40.将y10纯种菌剂与桂花曲按照重量比1:19比例进行混合。
41.(3)固态小试发酵试验
42.在实验室小试平台，糯高粱经65℃水浸泡24h，浸泡好的粮食放入灭菌锅中进行初蒸，115℃，10分钟。初蒸完毕后，加入100℃水进行焖粮5分钟，过滤完水再放入灭菌锅中进行复蒸，111℃，10分钟。将复蒸好的粮食冷却至30℃，分装进12号自封袋中，每袋1.05kg，按干粮重1％的下曲量加入步骤(2)所制备的混合酒曲，将曲与粮食搅拌均匀，放入培养箱在30℃下开口糖化24h，并用湿毛巾封住开口。糖化完成后，提前将酒糟进行灭菌，121℃，30分钟，然后按照单个样品500g的量称取酒糟，按照糖化好的粮食与灭菌酒糟质量比为1:1进行混合，混匀后装入气体采样袋，密封，抽真空，放入培养箱于30℃发酵7天，7天后将发酵好的酒醅装入特制三角烧瓶进行蒸馏，酒样取前100ml，得小曲清香型原酒。
43.(4)原酒检测及数据对比分析
44.将步骤(3)获得的原酒准确移取1ml于2ml样品瓶中，加入10μl三内标使用液(叔戊
醇(is1)：17028.1mg/l，乙酸正戊酯(is2)：16864mg/l，2-乙基己醇(is3)：12104.2mg/l)，盖上瓶盖，摇匀，采用气相色谱法测定原酒中各成分含量。色谱条件为：agilent 780a气相色谱仪，检测器fid，cp-wax毛细管色谱柱(50m*0.2μm*0.25mm)。升温程序：柱温40℃保持8min，以5℃/min升至150℃。进样口温度250℃，检测器温度260℃，空气、氢气流速比300:30，载气为氮气，分流比30:1，柱流量1.0ml/min，进样方式：自动进样器。检测结果见表1。
45.表1三轮次筛选酵母混合酒曲应用于小曲白酒生产数据对比情况
[0046][0047][0048]
从表1中可以看出，y10酒曲产酒中乙酸乙酯含量最高，为1.07g/l，而对照酒曲中乙酸乙酯含量为0.69g/l，比对照显著提升了55.07％。酒率、甲醇和正丙醇指标与对照相当，乙醛比对照降低28.07％，杂醇油比对照降低6.94％。因此，可以看出在原有酒曲的基础上添加费比恩毕赤酵母y10在提乙酸乙酯方面具有明显优势。
[0049]
实施例2
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高产酯毕赤酵母菌株耐受性试验
[0051]
白酒发酵过程是十分复杂的，酵母菌株会受到胁迫条件影响，如高温、高糖、高酒精、高渗透压环境，因此生产中对菌株的生理特性有一定的要求，获得的菌株并开展对生存环境的耐受性研究也是进行工业应用的基础。我们对产乙酸乙酯较高的4株毕赤酵母菌株进行了一系列的耐受性试验，具体如下：
[0052]
(1)耐温试验
[0053]
以2％接种量接种y10、y14、y42和y87酵母种子液至ypd液体培养基中，分别在15℃、25℃、30℃、37℃、45℃静置培养2d后，在600nm波长处测定吸光值，试验结果见图2。
[0054]
从图2可知，当温度超过37℃，所有菌株生物量均显著下降，在45℃的高温环境下几乎无生长。其中，y10在37℃有最高生物量，y42和y87在30℃有最高生物量，y14在25℃有最高生物量，结果表明相较其他3株酵母，y10菌株对高温环境具有较好耐受性。
[0055]
(2)耐乙醇试验
[0056]
用无水乙醇调节ypd液体培养基的乙醇浓度分别为3％、6％、9％、12％、15％、18％(v/v)，按2％接种量接种y10、y14、y42和y87酵母种子液，于30℃摇床培养2d后，在600nm波长处测定吸光值，试验结果见图3。
[0057]
由于发酵过程产生的高浓度乙醇会对酵母细胞代谢带来毒害，使酵母停滞生长或死亡。从图3可知，随着乙醇含量的增加，菌株生长受到抑制，所有菌株可耐受6％的乙醇含
量，随后随着乙醇含量增加，菌株生物量显著下降。而发酵后期酒醅中乙醇浓度不超过6％，因此该四株毕赤酵母均能够耐受发酵过程中乙醇含量的增加。
[0058]
(3)耐高糖试验
[0059]
用葡萄糖调节ypd液体培养基的糖浓度分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％(m/v)，按2％接种量接种y10、y14、y42和y87酵母种子液，于30℃培养摇床2d后，在600nm波长处测定吸光值，试验结果见图4。
[0060]
从图4可知，随着葡萄糖含量增加，酵母生物量随之降低。y10和y14菌株最高可耐受50％的葡萄糖含量，y87和y42菌株在60％的高糖环境下仍可生长，表明耐受性较好。
[0061]
(4)耐高盐试验
[0062]
用nacl调节ypd液体培养基盐含量分别为2％、6％、8％、10％、12％、14％(m/v)，按2％的接种量接种y10、y14、y42和y87酵母种子液，于30℃摇床培养2d后，在600nm波长处测定吸光值，试验结果见图5。
[0063]
由图5可知，随着nacl含量增加，酵母生物量随着减少。y10和y14菌株最高可耐受6％的盐含量，y87和y42菌株最高可耐受10％的盐含量，其中y42菌株在任一nacl含量下均具有最高生物量，当nacl含量达到14％时，其他菌株均无生长，而y42菌株仍有少量生长，表明y42菌株对盐耐受性较好。
[0064]
(5)耐酸试验
[0065]
用0.1mol/l hcl和0.1mol/l naoh将ypd液体培养基的ph分别调节为：ph＝1.5、ph＝2.0、ph＝2.5、ph＝3.0、ph＝4.0、ph＝4.5，按2％的接种量接种y10、y14、y42和y87酵母种子液，于30℃摇床培养2d后，在600nm波长处测定吸光值，试验结果见图6。
[0066]
由于高浓度的酸类物质会降低酵母细胞的代谢速率，抑制或杀死细胞，从而影响发酵能力。如图6所示，随着ph降低，酵母生物量随之降低，但所有菌株在ph高于3.0的条件下能较好生长。酒醅发酵过程ph值为4左右，因此该4株毕赤酵母能够适应酒醅的酸性环境。
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菌种库保藏编号为cctcc no:m2022527的费比恩毕赤酵母(pichia fabianii)y10。y10酵母菌落特征为：乳白色奶酪状，表面光滑微有突起，反光，边缘波浪状，菌落易挑起，参见图1。在ypd液体培养基摇床培养24h的显微形态特征是：细胞呈圆形或椭圆形，出芽增殖。