一种脂肪干细胞外泌体及其应用的制作方法

1.本说明书涉及医疗美容领域，特别涉及一种脂肪干细胞外泌体。


背景技术：

2.随着人们生活节奏的日益加快，越来越多的人受到了脱发的影响。脱发会对人们的自信和自尊产生消极作用，从而影响心理健康甚至生活状态。脱发作为一种皮肤科的常见疾病，其患病率较高且常常影响患者身心健康。现有的治疗手段主要有药物、激光、手术等方式，但这些手段面临着治疗周期长、药物副作用、费用高和有创等不足，因此脱发治疗一直是国际上的难点和热点问题，如何促进毛发再生是学界亟待解决的难题。脂肪干细胞(adipose derived stem/stromal cells，adscs)是成人祖细胞的其中一种来源，它是从脂肪组织中分离提取出来的，跟骨髓间充质干细胞和外周血干细胞具有同等多向分化潜能的基质细胞，因为相对丰富、易于分离、供体部位并发症少、自我更新能力强、增殖潜能高、扩张迅速和免疫原性低而成为非常具有前景的干细胞来源。adscs可以旁分泌多种生长因子，是adscs发挥治疗作用的关键，这些生长因子具有治疗作用，可以参与到细胞增殖和凋亡、免疫调节、血管新生、炎症反应中，在组织修复和再生医学中运用广泛，并且有望成为基于组织再生改善皮肤老化的理想方法之一。现已证实，脂肪干细胞局部注射，可以促进毛囊生长，使休止期的毛囊进入生长期。脂肪干细胞具有强大的成脂分化能力。但是，干细胞治疗存在着细胞扩增时间长、细胞增长难于与注射治疗精确匹配、细胞体内存活时间短等问题。
3.外泌体(exosome)是直径为30-150nm的胞外囊泡，是由多泡体与细胞膜融合而释放到细胞外的膜性囊泡状小体，具有来源细胞的胞质和胞膜成分，含有多种蛋白质、核酸和脂质等成分，是细胞间通讯的重要载体，几乎所有细胞均可释放外泌体。外泌体属于无细胞成分，可被细胞分泌到胞外环境中，其更加稳定、容易储备、运输，能够避免细胞治疗带来的免疫排异、致瘤、致栓的问题。在疾病治疗上也具有巨大的临床研究前景。并无现有技术披露外泌体与毛囊的关联。


技术实现要素：

4.根据本技术的一方面，提供了脂肪干细胞外泌体在制备促进毛囊增长的产品中的应用。
5.根据本技术的另一方面，提供了一种适于促进毛囊增长的脂肪干细胞外泌体，所述脂肪干细胞外泌体来自脂肪干细胞和/或成脂诱导脂肪干细胞。
6.根据本技术的又一方面，提供了一种促进生发的药物组合物，所述药物组合物含有上述的脂肪干细胞外泌体和常规的药用载体。
7.本技术公开的一种脂肪干细胞外泌体及其应用，带来的有益效果包括但不限于：(1)外泌体属于无细胞成分能够减少或避免细胞治疗带来的免疫排异、致瘤、致栓的问题。(2)外泌体属于无细胞成分，易于存储、运输、大规模生产及转化为产品。(3)本技术优选方案中，外泌体来源于成脂诱导脂肪干细胞，此成脂诱导脂肪干细胞分泌外泌体的能力更强。
(4)成脂诱导脂肪干细胞的外泌体可以促进毛囊细胞生长，从根本上解决脱发的原因。(5)不需要服用药物，减少药物带给肾脏肝脏的副作用。
附图说明
8.本技术将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
9.图1为根据本技术一些实施例所示的脂肪干细胞成脂分化特征图；
10.图2为根据本技术一些实施例所示的检测支原体污染的荧光图；
11.图3为根据本技术一些实施例所示的外泌体的透射电镜图；
12.图4为根据本技术一些实施例所示的western blot鉴定外泌体标记蛋白图；
13.图5为根据本技术一些实施例所示的外泌体的粒径分析图；
14.图6为根据本技术一些实施例所示的脂肪干细胞促进小鼠毛发增长的结果图；
15.图7为根据本技术一些实施例所示的色素沉着评分对比图。
具体实施方式
16.为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
17.如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
18.本说明书中使用了一定的文字记载顺序用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照文字记载顺序来精确地执行。相反，可以根据具体情况按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
19.外泌体(exosome)是一种由胞内质膜性细胞器内质网和高尔基复合体主动合成并分泌到细胞外环境的直径在30～150nm左右的微型质膜囊体结构，是细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式，外泌体具有来源细胞的胞质和脂质膜成分，并且含有来源细胞特异性蛋白以及相关蛋白cd63、cd9和cd81等。外泌体成分主要包括：microrna、mrna，细胞因子等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能。外泌体可通过细胞内吞作用摄入细胞，避免大分子因细胞膜通道阻挡而不易被细胞吸收的问题，具有生物活性高，作用效率高的优点。
20.本技术经研究意外发现，脂肪干细胞外泌体具有促进毛囊增殖的作用。毛囊由休止期进入生长期时，伴随着真皮脂肪组织的增生，对毛囊的生长发育起着至关重要的作用。毛囊再生需要脂肪细胞分泌特殊的营养物质，我们通过将脂肪干细胞诱导为脂肪细胞，提取外泌体，通过局部注射，意外发现该外泌体可到达促进毛囊增长的作用。
21.本技术的脂肪干细胞外泌体可以来自脂肪干细胞。为了提高脂肪干细胞外泌体产量，在一些实施例中，可以将脂肪干细胞诱导为成脂诱导脂肪干细胞。在一些实施例中，脂肪干细胞外泌体可以来自成脂诱导脂肪干细胞。
22.某些细胞因子和激素对于脂肪干细胞成脂分化的影响具有浓度和时间效应，即根据浓度和作用于成脂分化阶段的不同，可能发挥促进或抑制成脂分化的双向作用。在一些实施例中，成脂诱导脂肪干细胞可以由脂肪干细胞使用成脂诱导培养基诱导培养得到。现有的脂肪干细胞成脂诱导方法均适用于本技术。成脂诱导培养基通常可以在基础培养基的基础上，添加入分化诱导因子。分化诱导因子可以选自：激素类物质、细胞因子等，例如，可选自地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤或吲哚美辛中的一种或多种。在本技术的一个具体实施方式中，各促进干细胞分化成分的终浓度如下所示：地塞米松0.1μμ，胰岛素10μg/ml，异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)0.1mm，吲哚美辛100μm。在一些实施例中，脂肪干细胞诱导培养7天后可以出现成脂分化特征。
23.成脂诱导脂肪干细胞应当具有成脂分化特征，例如油红o染色出现脂滴，pparγ、lpl、脂肪酸结合蛋白4、激活蛋白2、瘦素、葡萄糖转运蛋白4等成脂相关基因和蛋白的表达。在一些实施例中，脂肪干细胞外泌体中可以含有外泌体标志蛋白cd63和cd81。
24.当脂肪干细胞使用含血清的培养基培养时，因为血清中含有很多外源蛋白，容易使外泌体中引入外源蛋白。为了除去外源蛋白，本说明书实施例之一提供一种上述脂肪干细胞外泌体的制备方法。在一些实施例中，在细胞诱导分化后可换无血清培养基培养24h-48h。无血清培养基可以采用常规的无血清培养基，其中可加入适当浓度的抗生素和血清替代物。在一些实施例中，无血清培养基可以是含有egm-2mv、1x血清替代物和1％青链霉素双抗的培养基。
25.通常情况下细胞上清中会含有细胞碎片等杂质，为了除去这些杂质，在一些实施例中，可以收集上清，离心，弃上清，以弃掉上清中的杂质。在一些实施例中，可以重悬外泌体，以用于外泌体的多次洗涤。在一些实施例中，可以使用pbs或其他磷酸盐缓冲液重悬外泌体。
26.为了减少外泌体的损失，可以使用长时间高速离心。在一些实施例中，离心的时间可以为60min-80min。在一些实施例中，优选的，离心的时间可以为70min。在一些实施例中，离心的转速可以为10000g-100000g。
27.当长时间高速离心时，离心机内的温度会随着时间上升，所以需要使用能控温的离心机操作此步骤。在一些实施例中，离心的温度可以为2℃-6℃。在一些实施例中，优选的，离心的温度可以为4℃。
28.外泌体中含有蛋白，为了防止蛋白降解，在一些实施例中，外泌体可以在-80℃冰箱保存。
29.本说明书实施例之一还提供一种脂肪干细胞外泌体在制备促进毛囊增长的产品中的应用。示例性的，促进毛囊增长的产品应用于阻止毛囊脱落，防止毛囊受损，促进毛囊生长。在一些实施例中，所述应用可以为促进生发。
30.本说明书实施例之一还提供一种促进生发的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物可以含有上述的脂肪干细胞外泌体和常规的药用载体。在一些实施例中，药物组合物可以含有成脂诱导脂肪干细胞外泌体。在一些实施例中，药物组合物可以是注射剂、片
剂、胶囊剂、微粒、软膏剂等。
31.在一些实施例中，药用载体可以包括药学上可接受的乳液成分、面霜成分、注射液。在一些实施例中，药用载体可以为高浓度血小板血浆、角蛋白或透明质酸中的一种或多种。在一些实施例中，药用载体可以包括辅料或冻干保护剂。辅料包括矿油、硬脂酸、棕榈酸、甘油硬脂酸酯、牛油果树果脂、肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯、氢化聚癸烯、氢化聚异丁烯、三甲基硅烷氧基硅酸酯、聚二甲基硅氧烷、山嵛醇、辛酸/癸酸甘油三酯甘油、泛醇等适用于面霜的成分；也可为丁二醇、双丙甘醇、山梨糖醇、甘油、透明质酸钠、海藻糖、神经酰胺、氨基酸、山梨糖醇、甜菜碱、聚乙二醇-6等适于制作面膜的成分；还可以为透明质酸钠、壳聚糖、胶原蛋白或者生理盐水等制备成注射剂型；还可以为冻干保护剂，如海藻糖，甘露醇，葡聚糖，聚乙二醇，氨基酸等可直接用于皮肤的物质。
32.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
33.实施例1
34.试验步骤：
35.1.脂肪干细胞与成脂分化脂肪干细胞制备：
36.取小鼠腹股沟区脂肪，小心用镊子分离脂肪并置于20ml pbs中，剪弃明显的血管，再用无菌pbs清洗1遍，后转移至无菌皿盖用无菌剪刀剪至乳糜状。
37.消化：将1ml枪头剪开(使开口变大)，吸取胶原酶放入皿盖中，连同乳糜状脂肪一起置入4-5ml 0.075％i型胶原酶中，37℃,120rpm摇床消化10-15min,然后2000rpm,离心5min,弃上层脂肪和上清，用培养液重悬沉淀，接种于6cm培养皿中培养(共3ml培养基dmem+10％fbs+1％青链霉素)，待生长、传代至p3。
38.取第3代adscs，接种于10cm培养皿中，待细胞长至80％时，加入成脂诱导培养基(含地塞米松0.1μμ，胰岛素10μg/ml，异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)0.1mm，吲哚美辛100μm)培养，每3d换液一次。
39.2.诱导7天后进行油红染色：
40.按油红o异丙醇饱和溶液:蒸馏水＝3:2比例配制油红o染色工作液，滤纸过滤一遍；
41.培养皿中细胞用pbs清洗一遍，4％多聚甲醛4℃固定15min。
42.pbs清洗：
43.六孔板中每孔加入油红o染色工作液500μl，加盖，室温浸染10～15分钟，显微镜下观察到脂滴着色后，pbs清洗。
44.脱色：
45.吸取pbs，稍晾干(晾干立即进行后续操作)，生物安全柜中每孔加入等量异丙醇，将异丙醇吸出，除去多余染料。
46.甘油明胶封片(封片后可长期保存)。
47.显微镜观察、拍照，结果如图1所示，镜检观察可见葡萄样红色脂滴，说明培养的脂肪干细胞已分化为成脂诱导脂肪干细胞。
48.3.检测成脂分化指标：
49.培养板中细胞用pbs清洗2遍，弃pbs，每孔加入1ml transzol up裂解细胞，用移液枪反复吹打细胞，将裂解液移至1.5ml ep管，室温静置5分钟；
50.每管加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育3分钟；
51.12000rpm，4℃离心15分钟；离心后混合液体将分为三层:无色水相(上层)、中间层、粉红色有机相(下层)，rna在上层无色水相中；
52.将上层无色水相转移到新的无rna酶的离心管中，注意吸取时枪头不要贴壁，不要吸到中间相；
53.每管加入500μl异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10分钟后；
54.12000rpm，4℃离心10分钟，可见管底部和侧壁上形成胶状沉淀块；
55.弃上清，每管加入1ml 75％乙醇(用100％乙醇及depc处理的水配制)，剧烈涡旋；
56.7500rpm，4℃离心5分钟；
57.弃上清，掌上离心机短暂离心甩下管壁上的乙醇，并小心吸去管底大部分乙醇溶液，使rna沉淀在室温空气中干燥约5分钟，至白色沉淀变成半透明；溶解rna沉淀：每管加入无rna酶的水20μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解。
58.测浓度:用超微量紫外可见分光光度计，测得rna溶液的浓度；
59.根据5x all-in-one rt mastermix反转录试剂盒操作说明，进行反转录；
60.获得的cdna进行荧光定量pcr，发现脂肪干细胞向成脂诱导脂肪干细胞分化时，基因c/ebpβ，adiposin，lpl表达显著。
61.4.检测培养液中是否存在细菌和支原体：
62.盖玻片上培养细胞；细胞处于70％汇合度时，用于支原体的检测。
63.用不含酚红的hanks液漂洗盖玻片；
64.加入固定液5ml，放置10min；
65.去离子水漂洗；
66.二苯甲酰胺荧光染料(hoechst 33258)工作液5ml染色10min；
67.盖玻片空气中干燥，细胞面向上，滴加ph5.5的磷酸缓冲液数滴，在荧光显微镜下观察，结果如图2所示，在细胞表面的无着色，说明样品无支原体污染，可用于后续实验。
68.5.外泌体的提取：
69.当经步骤1培养的细胞融合度达到80％左右时，吸弃培养基，用pbs清洗2遍，然后换为无血清培养基(egm-2mv+1x血清替代物+1％青链霉素双抗)，培养24-48h收集上清。
70.将上清依次进行如下离心(4℃下进行)：
71.300g,10min；2000g,10min；10000g,30min，留上清，用0.22um滤头过滤。
72.超速离心法收集外泌体：(超速离心机进行)
73.在4℃条件下，超速离心机内以100000g进行离心，离心70min，弃上清，将外泌体重悬汇总到一个离心瓶。
74.再次在4℃条件下，超速离心机内以100000g进行离心，离心70min，弃上清，用200ul pbs重悬外泌体，取少量测浓度，-80℃冰箱保存。
75.实施例2
76.通过透射电镜(tem)观察实施例1获得的成脂诱导脂肪干细胞外泌体的形态，结果如图3所示。电镜下观察可见，以上提取方法得到的外泌体均呈现出外泌体典型形态，为圆
形或椭圆形的囊泡状结构。
77.实施例3
78.westernblot检测外泌体的表达：
79.制样:配制裂解缓冲液，成分如下:50mm tris,ph7.4,40mm nacl,1mm edta,0.5％tritonx-100,50mm naf,10mm焦磷酸钠,10mm甘油磷酸钠及相应的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的混合物。将裂解缓冲液加入实施例1获得的成脂诱导脂肪干细胞外泌体adsc-exos并置于冰上裂解30min，收集至1.5ml ep管中，10,000rpm，10min离心后收集上清。用上述bca蛋白定量试剂盒按照说明书步骤测定adsc-exos蛋白浓度。然后将adsc-exos样本与上样缓冲液(5
×
)混合，100℃加热10min使蛋白变性,再置于-80℃保存。
80.电泳:配制sds-page凝胶，将配好的胶装入电泳槽内，并在内外倒入电泳缓冲液，用微量移液器将marker和样品加入上样孔内，每孔加入30μg样品。恒压80v跑至分离胶后将电压调到120v,观察蛋白marker，蛋白条带分开后即停止电泳。
81.转膜:将pvdf膜剪成6.6x8.5cm大小，并在甲醇中活化5min，置于转膜缓冲液中备用。取出已电泳完成的凝胶并用水冲洗掉电泳液。按照以下顺序安装转印系统:阴极夹板
→
海绵
→
滤纸
→
凝胶
→
pvdf膜
→
滤纸
→
海绵
→
阳极夹板。将上述转膜装置置于泡沫冰盒中并加入转膜缓冲液(凝胶靠近负极、pvdf膜靠近正极)，在100v电压下转膜1.5h。
82.封闭:转膜完成后将pvdf膜浸泡在5％的脱脂牛奶中进行封闭。用1xtbst配置5％的脱脂牛奶，tbst则用500μl吐温20溶于500ml 1xtbs配制，然后将pvdf膜置于5％的脱脂牛奶中在室温下摇床封闭1h。
83.一抗孵育:封闭结束后弃封闭液，用1xtbst洗膜，5min/次，共5次。稀释一抗:tsg101(1:1000稀释,abcam ab125011)、cd9(1:1000稀释,abcam ab92726)、cd81(1:1000稀释,abcam ab109201)按相应比例稀释，然后将pvdf膜用一抗在4℃条件下孵育过夜。
84.二抗孵育:回收一抗后再次用1xtbst洗膜(5min/次，共5次)，然后将二抗以1:5000比例稀释，在室温摇床上孵育1h。
85.化学发光和显影:通过化学发光系统曝光并显影，详细记录样品及顺序、抗体信息，保存数据结果。
86.结果如图4所示，说明成脂诱导脂肪干细胞中表达外泌体标志蛋白cd63和cd81，进一步说明所鉴定即为脂肪干细胞外泌体。
87.实施例4
88.用zetaview pmx 110(particle metrix,德国)对实施例1获得的成脂诱导脂肪干细胞外泌体的粒子直径进行检测。
89.用去离子水清洗样本池，zetaview system用聚苯乙烯微球(100nm)校准；
90.用1x pbs清洗样本池；
91.分离的adsc-exos用1x pbs稀释后进样检测；
92.记录和分析11个点，温度保持在23℃-30℃；
93.得到数据后保存并使用origin软件作图，绘制nta粒径分析曲线，结果如图5所示，结果显示其平均大小约175nm，基本符合外泌体大小。
94.实施例5
95.体内小鼠实验：
96.取8周的成年c57/6j小鼠，在这一时期的小鼠毛发处于休止期。应用电动推毛器推光背部2cmx2cm面积的毛发。小鼠分为三组：a组:对照组，皮下注射250μl pbs；b组:背部皮下注射250μl脂肪干细胞外泌体(400μg/小鼠,50μl/每个注射点,共5注射点)；c组:背部皮下注射250μl实施例1制得的成脂诱导脂肪干细胞外泌体(400μg/小鼠,50μl/每个注射点,共5注射点)；14天后观察毛发再生状态并拍照，结果如图6所示。从图6可以看出，c组背部毛发明显多余其他两组，说明成脂诱导脂肪干细胞外泌体促进毛发增长的效果显著。
97.处死小鼠，取背部皮肤进行h&e染色：
98.固定：用4％多聚甲醛固定切取的皮肤组织。
99.脱水：将固定好的皮肤组织依次放入梯度酒精中脱水，75％酒精中过夜，85％酒精中2h，90％酒精中1h，95％酒精中1h，100％酒精ⅰ中30min，100％酒精ⅱ中30min。
100.透明：将皮肤组织依次放入二甲苯ⅰ中透明10min，二甲苯ⅱ中透明5-10min。
101.包埋：将皮肤组织依次放入石蜡ⅰ、ⅱ、ⅲ中各浸蜡1h，修整。
102.切片：把修整好的石蜡块放置在切片机上连续切片，每片厚4μm。
103.摊片：将切好的石蜡切片漂浮于40℃温水表面上展平，用防脱处理过的载玻片捞起。
104.烤片：将载玻片放置在60℃烘箱中烘烤2-3h。
105.脱蜡:将切片放入二甲苯，脱蜡15分钟。
106.复水:将切片依次放入100％、95％、85％、75％乙醇中，每个梯度酒精5分钟；蒸馏水1分钟。
107.苏木素染色8分钟。
108.水洗:蒸馏水洗去多余浮色。
109.分化:1％盐酸乙醇分化数秒。
110.返蓝:自来水流水冲洗10分钟。
111.伊红染色1分钟。
112.蒸馏水洗去浮色；脱水:75％、85％、95％、100％酒精梯度脱水，每个梯度5分钟。
113.透明:二甲苯透明，10分钟。
114.封片:中性树胶封片。
115.通风橱中通风散味，显微镜下观察，并统计毛囊数量，结果如图7所示，小鼠背部皮下注射成脂诱导脂肪干细胞外泌体后，相较于其他两组小鼠，毛囊数量显著增加，说明成脂诱导脂肪干细胞外泌体可以明显改善小鼠背部毛囊数量。
116.上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
117.同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
118.最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。