一株地衣芽孢杆菌BA1001、驯化筛选方法及其应用与流程

一株地衣芽孢杆菌ba1001、驯化筛选方法及其应用
【技术领域】
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株地衣芽孢杆菌ba1001、驯化筛选方法及其应用。


背景技术：

2.草甘膦(glyphosate，n-膦酰基甲基甘氨酸)又称农达(roundup)，作为一种有机磷类除草剂，是目前应用最广、产量最大的除草剂产品，但其降解缓慢，长期使用对土壤、水源及其生态系统造成了严重影响。
3.目前，草甘膦的降解方式主要有水解、光化学降解、生物降解等，其中生物降解是利用对草甘膦具有降解能力的微生物将农药残留转化分解，因此生物降解对环境没有负面影响，且具有速度快、成本低、范围广、效率高等优点。自然界中存在很多能够降解其他有机磷类的菌株，但是这些菌株对草甘膦的降解能力有限，因此，筛选高效稳定的降解草甘膦菌株对丰富生物降解种子库资源，推动微生态改良剂的研究与开发具有重要的现实意义。


技术实现要素：

4.针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供一株对地衣芽孢杆菌ba1001、寻化筛选方法及其应用，所述地衣芽孢杆菌ba1001对草甘膦耐受性高，且可以高效降解草甘膦。
5.为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
6.一株地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)ba1001，所述地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)ba1001已于2022年2月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no:m 2022137。
7.所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)ba1001菌株来源于中药黄芪根部，所述菌株的菌体形态为：菌种呈浅白色，长圆形、芽孢囊不膨大，边缘光滑、无光泽、不透明；菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性。
8.本发明的第二目的在于，提供所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)ba1001的驯化筛选方法，具体包括如下步骤：
9.(1)菌株的筛选培养：无菌条件下，取经过预处理的黄芪根部样本置于含有草甘膦的 lb固体培养基中，于35～40℃静置培养，活化培养至平板铺满单菌落；
10.(2)菌株的分离纯化：挑取单个菌落，于含草甘膦的lb固体培养基上划线培养，重复 2-3次，直至平板菌落形态一致，镜检无杂菌；
11.(3)菌株的斜面培养：挑单个菌落接种于含草甘膦的lb固体斜面培养基上，于35～40℃培养活化至斜面铺满菌体；
12.(4)菌株的液体活化：由斜面培养基中挑取菌体接种于含草甘膦的液体lb培养基中，于35～40℃、100～200r/min条件下震荡培养24h，获得菌株培养液；
13.(5)菌株的驯化培养：吸取菌株培养液转接至含草甘膦的msm培养基中驯化培养，筛选出耐受性最强的菌株，并将驯化后的菌株进行斜面培养，置于4℃冰箱保存。
14.优选地，步骤(1)中黄芪根的预处理方法为：用75％乙醇清理根部表面，并在无菌条件下将黄芪根打浆，获得均浆液，进行后续分离筛选。
15.优选地，步骤所述lb养基主要成分为：酵母膏5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 5.0g/l。固体培养基加入1.7％琼脂粉，初始ph 7.0，121℃，20min灭菌。
16.优选地，步骤(5)所述msm培养基成分为：mgso4·
7h2o 0.05g/l，kh2po
4 0.5g/l， k2hpo
4 1.5g/l，nacl 1.0g/l。固体培养基加入1.7％琼脂粉；初始ph7.0，121℃灭菌20min。
17.优选地，步骤(4)制得的菌株培养液中的活菌数≥4*109cfu/ml。
18.优选地，步骤(5)制得的驯化后液体中的活菌数≥8*108cfu/ml。
19.优选地，步骤(5)中菌株的驯化培养具体为：吸取细菌培养液转接到含有草甘膦的msm 培养基中于35～40℃、100～200r/min震荡培养，在相同条件下，以500mg/l为间隔梯度，依次由含低浓度草甘膦的msm培养基中接种于含高浓度草甘膦的msm培养基中，筛选获得高耐受性菌株。
20.本发明的第三目的在于，提供一种调理剂，所述调理剂包含所述地衣芽孢杆菌ba1001。
21.本发明的第四目的在于，提供上述地衣芽孢杆菌ba1001或上述调理剂在降解草甘膦中的应用。
22.本发明的第五目的在于，提供一种抑菌剂，所述抑菌剂包含所述地衣芽孢杆菌ba1001。
23.本发明的第六目的在于，提供上述地衣芽孢杆菌ba1001或抑菌剂在抑制金黄色葡萄球菌或白色念珠菌中的应用。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.本发明所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)ba1001已于2022年2月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no:m 2022137；
26.本发明所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)ba1001对草甘膦具有高的耐受性，可耐受草甘膦浓度最高为10000mg/l，且对浓度为2500mg/l、5000mg/l、7500mg/l、10000mg/l 草甘膦的降解率分别为89％、89％、86％、83％，本技术所述地衣芽孢杆菌ba1001对草甘膦具有高效的降解力；
27.本发明所述地衣芽孢杆菌ba1001、其发酵液、发酵上清液对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均有很好的抑菌性能，可开发成相关微生态制剂。
【附图说明】
28.图1为所述地衣芽孢杆菌ba1001的菌株培养液镜检图片；
29.图2为所述菌株基于16srrna序列的系统发育树；
30.图3为所述地衣芽孢杆菌ba1001生长曲线图；
31.图4为所述地衣芽孢杆菌ba1001对草甘膦的耐受性；
32.图5为地衣芽孢杆菌ba1001对不同浓度地衣芽孢杆菌ba1001的降解能力图；
33.图6为草甘膦浓度为10000mg/l的培养基中不同时间段草甘膦的浓度变化情况图。
【具体实施方式】
34.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
35.下述实施例中用到的培养基成分如下：
36.lb培养基主要成分为：酵母膏5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 5.0g/l。固体培养基加入 1.7％琼脂粉，初始ph 7.0，121℃，20min灭菌。
37.所述msm培养基成分为：mgso4·
7h2o 0.05g/l，kh2po
4 0.5g/l，k2hpo
4 1.5g/l， nacl 1.0g/l。固体培养基加入1.7％琼脂粉，初始ph7.0，121℃灭菌20min。
38.实施例1菌株的分离培养
39.(1)黄芪预处理：取黄芪根部样本，用75％乙醇清理其表面，并在无菌条件下将黄芪根打浆，获得均浆液；
40.(2)菌株的筛选培养：无菌条件下，取黄芪的根部样本1g置于50ml含有100mg/l 草甘膦的lb固体培养基中，于35～40℃静置培养，活化培养至平板铺满单菌落；
41.(3)菌株的分离纯化：挑取单个菌落，于100mg/l草甘膦的lb固体培养基上划线培养，重复2-3次，直至平板菌落形态一致，镜检无杂菌；
42.(4)菌株的斜面培养：挑单个菌落接种于100mg/l草甘膦的lb固体斜面培养基；于 35～40℃培养活化至斜面铺满菌体，置于4℃冰箱保藏。
43.实施例2菌株的鉴定分析
44.1、菌株的形态学观察
45.1.1试验方法：挑取实施例1保存的菌体，接种于lb液体培养基，于37℃、150r/min 条件下震荡培养24h，获得菌株培养液，吸取培养液涂抹于载玻片中，经染色、脱色处理后，置于显微镜下观察菌体形态。
46.1.2结果分析
47.菌体形态为：菌种呈浅白色，长圆形、芽孢囊不膨大，边缘光滑、无光泽、不透明；菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性(如图1所示)。
48.2、菌株的分子鉴定
49.2.1试验方法
50.按照1.1的方法，获得菌株培养液，按照dna提取试剂盒(细菌基因组dna提取试剂盒(离心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司)的操作方法，提取菌株dna，送北京博尚生物技术有限公司进行16srdna测序分析。
51.2.2结果分析
52.经16srdna测序分析建立了系统进化树如图2所示，确定该菌株为地衣芽孢杆菌。
53.实施例3菌株生产曲线的建立
54.1、试验方法
55.用接种环挑取实施例1保藏于斜面培养基中的地衣芽孢杆菌ba1001菌体，接种于lb液体培养基中，于37℃、150r/min条件下震荡培养，分别于4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、 32h取样，计数，绘制生长曲线。
56.2、结果分析
57.所述地衣芽孢杆菌ba1001的生长曲线如图3所示，由图3可知，菌株在培养24h后进入生长对数期，此时菌体活菌数最多，活性最佳。
58.实施例4菌株的抑菌性能检测
59.在营养琼脂固体培养基上，分别加入100μl活化好的浓度为106cfu/ml的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌菌悬液，涂布均匀。将内径6mm的牛津杯置于涂有菌液的平板上，每块培养皿上放置6个牛津杯，作为平行样，在牛津杯中分别加入100μl浓度为108cfu/ml 的地衣芽孢杆菌ba1001发酵液、100μl的发酵上清液，并以抗菌肽为对照；将平板于37℃恒温培养24h后，用刻度尺采用十字交叉法测量抑菌圈大小，记录抑菌圈直径(mm)。
60.抑菌结果如表1所示：
61.表1地衣芽孢杆菌ba1001的抑菌性能检测结果(以抑菌圈直径标示)
[0062][0063][0064]
由表1可知，本发明地衣芽孢杆菌ba1001发酵液及发酵上清液对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均有抑制功能，对大肠杆菌无明显抑制作用。
[0065]
因此，可以将所述地衣芽孢杆菌ba1001发酵液或发酵上清液开发成抑菌剂，所述抑菌剂可以以所述地衣芽孢杆菌ba1001发酵液或发酵上清液为主要活性成分，也可以将其作为辅助成分与其他微生物或功效成分配合使用。
[0066]
实施例5菌株的驯化培养
[0067]
(1)菌株的液体活化：由实施例1保存的斜面培养基中挑取菌体接种于置于50ml含有 100mg/l草甘膦的液体lb培养基，于35～40℃、100～200r/min条件下震荡培养24h，获得菌株培养液，菌株培养液中活菌数≥4*109cfu/ml；
[0068]
(2)菌株的驯化培养：吸取10ml细菌培养液转接到100ml含有500mg/l的草甘膦的 msm培养基中，于35～40℃、100～200r/min条件下震荡培养24h，在相同条件下，以500mg/l 为间隔梯度，依次由含低浓度草甘膦的msm培养基接种于含高浓度草甘膦的msm培养基中，筛选获得高耐受性菌株，驯化后液体中的活菌数≥8*108cfu/ml；并将驯化后的菌株进行斜面培养，置于4℃冰箱保存。
[0069]
实施例6驯化菌株对草甘膦的耐受性及对草甘膦的降解能力检测
[0070]
分别配制含草甘膦浓度为500mg/l、1000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、2500mg/l、3000mg/l、 3500mg/l、4000mg/l、4500mg/l、5000mg/l、5500mg/l、6000mg/l、6500mg/l、7000mg/l、 7500mg/l、8000mg/l、8500mg/l、9000mg/l、9500mg/l、10000mg/l、10500mg/l、11000mg/l、的msm培养基，按照10％的接种比例，接种实施例5驯化好的地衣芽孢杆菌ba1001，于 37℃下，震荡培养24h，分别取样，以未接种的培养基为对照培养基，波长600nm
波长条件下，检测菌液od值，绘制曲线，结果如图4所示；
[0071]
并检测培养24h后各培养基中草甘膦的浓度，计算本发明所述地衣芽孢杆菌ba1001对不同浓度草甘膦的降解率，结果如图5所示；
[0072]
对草甘膦浓度为10000mg/l的培养基中不同时间段草甘膦的浓度进行测定，结果如图6 所示。
[0073]
由图4可知，在草甘膦浓度低于10000mg/l的条件下，地衣芽孢杆菌ba1001菌体长势良好，但高于10000mg/l时菌株生长缓慢，菌体浓度下降，长势差；因此，本发明所述地衣芽孢杆菌ba1001对草甘膦的最大耐受浓度为10000mg/l。
[0074]
由图5可知，本发明所述地衣芽孢杆菌ba1001对2500mg/l、5000mg/l、7500mg/l、 10000mg/l草甘膦的降解率分别为89％、89％、86％、83％，说明本技术所述地衣芽孢杆菌ba1001对草甘膦具有高效降解力。
[0075]
由图6可知，本发明所述地衣芽孢杆菌对草甘膦的降解率与菌体长势呈正相关。
[0076]
可以将所述地衣芽孢杆菌ba1001开发制备成调理剂，所述调理剂可以将所述地衣芽孢杆菌ba1001作为主要活性成分，也可以将所述地衣芽孢杆菌作为辅助成分与其他微生物或功效成分配合使用；所述调理剂可用于降解土壤或水体中的草甘膦。
[0077]
以上所述实施例仅表达了本技术的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本技术保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。