青霉ZC1菌株及其在绿肥残体降解中的应用

青霉zc1菌株及其在绿肥残体降解中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及棘孢木霉zc1菌株及其在绿肥残体降解中的应用。


背景技术：

2.绿肥是指利用植物生长过程中所产生的全部或地上部绿色体，直接或间接翻压到土壤中作肥料或通过它们与主作物的间套轮作，起到促进主作物生长、改善土壤性状等作用的绿色植物体(曹卫东等，2010)。绿肥作物是农业生态系统中一种十分宝贵的有机物资源，富含碳、氮、磷、钾及主作物生长所需的其他微量元素。绿肥作为清洁的有机肥源，在培肥地力和替代化肥方面具有重要作用，是现代化农业的重要特征之一。
3.我国绿肥资源丰富，据统计常用绿肥作物有916种，在经过生长适应性筛选之后，得到了70多种能够适应不同地区气候环境且生长状况良好的绿肥作物(曹卫东等，2017)。目前适合种植的绿肥品种繁多，主要包括豆科和禾本科。豆科绿肥自身具有固氮作用，生物量较大，碳氮比较低，能够向土壤中输入大量的碳素和氮素的优点。国外常见的种植豆科绿肥主要以三叶草、野豌豆为主(rodrigues et al.,2015；hogue et al.,2010；wells.,2012)。国内常见绿肥主要包括光叶苕子、毛叶苕子、紫云英和多年生的三叶草为主。禾本科绿肥的优点是自身碳氮比较高，根系发达且以须根为主，在土层中分布不深，对主作物根系无不良影响。常见的种植禾本科绿肥主要以黑麦草和茅草为主(tworkoski et al.,2012；ripoche et al.,2011；gouthu et al.,2012；)。
4.目前绿肥的利用方式主要有压青、覆盖和自传种三种(周志翔等，1997；杨叶华，2020)。压青分为就地翻压和刈割填埋两种。就地翻压指的是通过翻压机械或者是人力劳作将新鲜绿肥直接翻压进土壤，翻压深度为20cm左右；刈割填埋指的是将绿肥地上部全部或部分刈割后集中填埋进土壤中。覆盖分为树盘覆盖和自然枯萎覆盖，树盘覆盖指的是人工将绿肥刈割后覆盖在主作物的树盘处(杨叶华，2020)；自然枯萎覆盖指的是随着绿肥完成自身的生育期自然死亡后，植物残体保留在土壤上。
5.中国常见绿肥平均产量为38.0t/hm2，其中禾本科最高，禾本科黑麦草绿肥平均产量达53.2t/hm2，其次是豆科，豆科绿肥产量在46.8～48.2t/hm2之间，十字花科最低，十字花科油菜、肥田萝卜和二月兰绿肥产量均低于20.0t/hm2且差异不显著，仅为黑麦草产量的1/3左右(杨叶华等，2020)。对于生物量大的绿肥，与其他方式相比，自然枯萎覆盖后自然腐解于田间的利用方式不仅可以培肥土壤、补充土壤有机质、为主作物提供养分，并且可以节约成本，是绿肥轻简化种植利用的主要方式。
6.绿肥与秸秆等其他有机物料相比具有碳氮比低、微生物分解快的特点。但由于绿肥本身的老嫩程度不同，自然枯萎还田后幼嫩绿色茎叶容易腐解，但枯老茎叶纤维素、木质素多，水分少，难以腐解。此外，干旱、土壤过酸过碱、温度过高或低温都会影响绿肥的分解。由于冬绿肥枯老茎叶较多，加上冬季温度较低，在田间自然腐解速度较慢。一般冬绿肥在每年9-10月播种，第二年6-7月自然枯萎覆盖，冬绿肥的腐解缓慢会直接影响夏绿肥的播种及
种子定殖、下扎，所以需要冬绿肥快速腐解转化为土壤有机质，为土壤补充养分的同时不影响夏绿肥的种植。
7.由于受农业技术、农户认知不足等实际条件的限制，我国绿肥产业发展较缓慢，目前相关的绿肥残体降解菌剂鲜有报道。基于此，亟需筛选出一种绿肥残体高效降解菌，以期助力绿肥产业的发展。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种青霉zc1菌株及其在绿肥残体降解中的应用。
9.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
10.1、青霉zc1菌株，其分类命名为青霉(penicillium sp.)zc1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.40237，保藏日期为2022年7月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
11.优选的，青霉zc1菌株的its序列如seq id no.1所示。
12.ggggacctgcggaaggatcattactgagtgagggcccctcggggtccaacctcccacccgtgtttaacgaacctttgttgcttcggcgggcccgcctcacggccgccggggggctcctgcccccgggcccgcgcccgccgaagcccccccttgaacgctgtctgaagtttgcagtctgagaaactagctaaattagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccctctggtattccggagggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccccctctgccggggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggcttcgtcacccgctcttgtaggcccggccggcgccagccgaccccaaccctaaatttttttcaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcataaaacc，如seq id no.1所示。
13.2、青霉zc1菌株在木质素、纤维素或半纤维素降解中的应用。
14.3、青霉zc1菌株在绿肥残体降解中的应用。
15.4、一种微生物菌剂，它的有效成分为前述的青霉zc1菌株，其质量含量为5～10％。
16.本发明的有益效果在于：
17.本发明从重庆市田间自然腐熟的绿肥残体中筛选分离获得一株青霉新菌株，即青霉(penicillium sp.)zc1。该菌株的生长速度快，分生孢子在72h内可铺满直径8cm培养皿。菌落灰绿色，在气生菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗，顶端以特殊的对称或不对称的扫帚状的方式分支，称为帚状枝，分支为多极的分生孢子梗最后产生许多瓶梗，在瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子为球形至卵形，呈绿色。菌落背面褐色。
18.在滤纸条降解培养基中，28℃培养5d其可使滤纸完全崩解；在绿肥残体降解试验中，zc1对绿肥残体的木质素降解率达到78.12％，纤维素和半纤维素降解率分别达到85.17％、84.46％。
附图说明
19.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
20.图1为zc1菌株愈创木酚、苯胺蓝平板显色反应；
21.图2为zc1菌株的纤维素、木质素酶活图，其中，a为纤维素酶活，b为木质素酶活；
22.图3为zc1菌株系统发育树；
23.图4为zc1菌株处理前后的花椒枝条电镜结构图，其中，a为ck未接菌处理，b为zc1菌株处理。
24.图5为葡萄糖标准曲线。
25.生物保藏信息
26.分类命名：青霉(penicillium sp.)zc1；
27.保藏编号：cgmcc no.40237；
28.保藏时间：2022年7月1日；
29.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
30.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
31.下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
32.实施例1
33.zc1菌株的分离鉴定
34.(1)供试材料
35.采集重庆市田间自然腐熟绿肥残体，选择腐熟程度高，颜色黑棕色，表面带有菌斑，质地潮湿柔软且没有刺鼻气味的完全腐熟物料，至于密封袋内，于实验室4℃冰箱保存。
36.(2)培养基
37.富集培养基：200g马铃薯提取液，葡萄糖20g，链霉素0.33g，蒸馏水1 000ml，ph自然。
38.木质素选择培养基：碱性木质素2g，硫酸铵1.33g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钠0.2g，链霉素0.33g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000ml(参照郭晓威等，2017；王晶等，2020)。
39.gu-pda培养基：200g马铃薯提取液，琼脂20g，用6g烘干绿肥粉(绿肥采自西南大学实验农场合川基地，采集冬绿肥枯老茎叶，洗净后65℃烘干至恒重，粉碎过40mm筛备用)代替葡萄糖，愈创木酚0.4m，加水定容到1l，121℃灭菌3min，用于定性测定菌株的产漆酶/过氧化物酶能力(如图1上半部分所示)。
40.ab-pda培养基：200g马铃薯提取液，琼脂20g，用6g烘干绿肥粉代替葡萄糖，苯胺蓝0.1g，加水定容到1l。
41.pda培养基：200g马铃薯提取液，葡萄糖20g，琼脂20g(液体培养基不加琼脂，半固体培养基加琼脂8g/l)。
42.(3)zc1菌株的分离、纯化
43.称取10g腐熟绿肥残体样品于90ml富集培养基中，28℃、120r/min培养48h，选择稀释梯度为10-1
、10-3
、10-5
、10-7
和10-9
，分别取100μl涂于木质素选择培养基上，28℃培养48h。挑取有明显真菌形态的菌株于gu-pda、ab-pda培养基上，挑选显色圈、变色圈明显的菌株于pda培养基反复纯化，直至纯培养后制成甘油菌液，-80℃保存菌种。具体见图1，上半部分是愈创木酚显色，下半部分是苯胺蓝显色。
44.将以上挑选的菌株命名zc1，并于2022年7月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为cgmcc no.40237，分类命名为青霉(penicillium sp.)zc1。
45.实施例2
46.zc1菌株的鉴定
47.1)形态学鉴定
48.将保藏的菌株zc1经pda培养基活化后，观察其菌落形态特征；然后使用插片法培养，置于显微镜下观察其形态结构。
49.zc1菌株形态如图1所示，菌落灰绿色，在气生菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗，顶端以特殊的对称或不对称的扫帚状的方式分支，称为帚状枝，分支为多极的分生孢子梗最后产生许多瓶梗，在瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子为球形至卵形，呈绿色。菌落背面褐色。生长速度快，分生孢子在72h内可铺满直径8cm培养皿。
50.2)生理生化鉴定
51.a.纤维素酶活测定：
52.①
种子培养基：蛋白胨5g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph 7.0。
53.发酵产酶培养基：蛋白胨3g，酵母浸粉0.5g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾4g，氯化钠0.3g，硫酸镁0.3g，cmc—na 20g，蒸馏水1000ml。
54.②
取直径为1cm的菌块5个，接种至种子培养基中，并在36℃，160r/min下培养18h以制备种子液。通过在200ml的发酵产酶培养基内加入3％接种量(体积)的种子液在36℃，160r/min培养24h，于4℃，5000r/min条件下离心10min，取上清液测定酶活。
55.③
滤纸酶活测定方法：在每个离心管中加入5ml从样品中提取的发酵液。放入离心机内以5 000r/min运行10min，得到上清液即为试验所需粗酶液。在粗酶液中，提取0.5ml来测定纤维素酶活力，并以新华滤纸50mg作为底物，并置于4支20ml具塞试管中，同时在4支试管内分别加入酶液0.5ml和柠檬酸缓冲液(0.05mol/l的柠檬酸缓冲液，配制方法参考刘娣，2008)1.5ml。在其中一个试管内加入1.5ml dns试剂作为对照组。把4支试管在50℃进行水浴预热，10min后加入50mg滤纸，并于该温度下反应60min，取出样品后在每个样品内立即加入2.0ml dns试剂，再次置于100℃水浴进行5min的反应，取出后待冷却，定容至15ml，并通过分光光度计测出每个样品的吸光度。测得的od值，通过绘制的葡萄糖标准曲线进行比对，并将od值换算成葡萄糖浓度。每小时底物产生1μmol葡萄糖所需酶量为一个酶活力单位(u)fpa公式如下：
[0056][0057]
式中：g为葡萄糖含量；v：定容体积；t：反应时间；a：加酶量；b：底物质量；5.56为1mg葡萄糖底物质的量(μmol)。
[0058]
④
葡萄糖标准曲线的制定：分别吸取0.1mg/ml葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5ml置于比色管中，用蒸馏水补充至1.5ml，再加2ml dns试剂，充分混合后在沸水中煮沸5min。冷却定容至15ml。用分光光度仪于540nm处测od值。以葡萄糖的含量(mg)为横坐标，以od值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，并拟合回归方程。如图5所示。
[0059]
纤维素酶活结果如图2中a所示。
[0060]
b.木质素酶活测定：
[0061]
①
液体培养基：葡萄糖20g，酵母浸粉5g，kh2po
4 1g，mgso4·
7h2o 0.5g，znso4·
7h2o 50mg，加水定容到1l，p h自然，分装至250ml锥形瓶中，每瓶倒入液体培养基100ml，121℃灭菌30min后，加入维生素b1 40μl。
[0062]
绿肥残体固体培养基：将绿肥残体于60℃烘干至恒重后粉碎，过40目筛，按照绿肥残体:水＝1:2.5的比例(质量比)加入到培养皿中，121℃灭菌30min。
[0063]
②
取直径为1cm的菌块5个，接种至液体培养基中，25℃、150r/min振荡培养6d。
[0064]
③
以种子发酵液体积：绿肥残体质量＝1:1的比例(质量比)将种子发酵液接种到绿肥残体固体培养基中，25℃培养30d，每5d取出3份预处理的绿肥残体样品，称取1g上述样品于离心管中，加蒸馏水3ml，25℃、150r/min震荡4h，4层纱过滤，滤液于4℃下3000r/min离心10min，取上清液，所得液体即为胞外粗酶液，于4℃冰箱保存(丛珊2014；叶建强等2018)。采用试剂盒(重庆阿米达生物技术有限公司)对预处理的绿肥残体样品中漆酶、锰过氧化物酶(manganese peroxidase，mnp)和木质素过氧化物酶(lignin peroxidase，lip)活性进行测定。漆酶活力单位的定义(u)：在波长420nm下，每分钟将1μmol 2,2
′‑
联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2
′‑
azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，abts)底物氧化所需的酶量。mnp活力单位的定义(u)：在波长465nm下，每分钟将1μmol愈创木酚氧化所需的酶量。lip活力单位的定义(u)：在波长651nm下，每1ml反应体系中每分钟吸光度值变化0.01为一个酶活单位。
[0065]
酶活结果如图2中b所示。
[0066]
数据分析：采用软件spss 22.0计算平均值和标准差，并分析各个处理之间的差异显著性。
[0067]
3)真菌its分子生物学鉴定
[0068]
将纯化好的菌株接种于100ml pda液体培养基上，过夜培养。漏斗过滤并吸干残留的培养液，转移至研钵后快速加入液氮将组织研磨成粉末状，立即将研磨后的粉末转移到1.5ml的eppendorf管中。加入2倍体积预热的质量浓度2％ctab(含有质量浓度0.1％β-巯基乙醇》充分混匀，65℃温浴30-45min，每15min混匀一次。冷却至室温，10000rmp离心10min，取上清转移至另一干净的1.5ml的eppendorf管中。加入等体积的tris酚-氯仿-异戊醇混合液(体积比25:24:1)抽提。10000rmp离心10min,取上清液转转移至另一于净的1.5ml的eppendorf管中。等体积氯仿-异戊醇混合液(体积比24:1)再抽提一次，颠倒混匀10min，10000rmp离心10min，取上清液转至另一于净1.5ml的eppendorf管中。加入0.6-0.7倍体积预冷的异丙醇沉淀dna，颠倒混匀，-20℃放置过夜。10000rnp离心10min，弃上清。沉淀用体积百分数75％的乙醇水溶液洗涤脱盐，无水乙醇洗涤脱水，置于37℃温箱中干燥10min。加入50μl ddh2o溶液溶解dna。
[0069]
its序列是位于idna编码基因18s，5.8s，28s之间的小基因片断，真核生物细胞中的its序列保守，不受所处环境条件的变化的影响。因此，采用通用引物分析真核生物细胞中的its碱基序列与其他微生物种之间its序列的同源性，可以分析它们的亲缘关系的距离和系统发育地位。
[0070]
its通用引物为：
[0071]
its1：5'ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3'，如seq id no.2所示；
[0072]
its4：5'tcctcc gcttattgatatgc-3'，如seq id no.3所示。
[0073]
pcr扩增程序为：94℃预变性5min后：开始循环94℃变性30s，52℃退火60s,72℃延伸2min，共30个循环，72℃延伸10min.取2μl反应液进行质量百分数1％琼脂糖电泳检测，pcr扩增产物送至上海美吉生物工程有限公司进行测序，将序列输入genbank进行序列同源性比较分析。
[0074]
4)its序列系统发育树的构建
[0075]
从genbank基因数据库中分别下载与降解菌株zc1的序列序列相似性大于97％的菌株的its序列。通过clustalx进行聚类分析后，利用mega4.1软件生成系统发育进化树。结果如图3所示。
[0076]
实施例3
[0077]
zc1菌株对绿肥残体粉降解能力的测定
[0078]
液体培养基：葡萄糖20g，酵母浸粉5g，kh2po
4 1g，mgso4·
7h2o 0.5g，znso4·
7h2o 50mg，加水定容到1l，p h自然，分装至250ml锥形瓶中，每瓶倒入液体培养基100ml，121℃灭菌30min后，加入维生素b1 40μl。
[0079]
绿肥残体固体培养基：将绿肥残体于60℃烘干至恒重后粉碎，过40目筛，按照绿肥残体:水＝1:2.5的比例(质量比)加入到培养皿中，121℃灭菌30min。
[0080]
以种子发酵液体积：绿肥残体质量＝1:1的比例将种子发酵液接种到绿肥残体固体培养基中，28℃培养40d，每隔10d取样(外加第5d取样)，40d后将样品取出，于60℃烘干至恒重，装入自封袋中备用。用扫描电镜观察样本的降解情况，如图4所示，其中，a为ck未接菌处理，图2为zc1菌株处理后。
[0081]
并测定预处理绿肥残体木质素、纤维素、半纤维素含量，如表1-3所示：(注：ck1为2代白腐菌ndm3-2，购自北京生物保藏中心；ck2为复合秸秆腐熟剂，购自仲禧生物科技有限公司，下同)
[0082]
表1 zc1处理绿肥残体40天木质素降解率
[0083][0084]
表2 zc1处理绿肥残体40天纤维素降解率
[0085]
[0086]
表3 zc1处理绿肥残体40天半纤维素降解率
[0087][0088]
由表1-3可知，本发明的青霉zc1菌株在绿肥残体木质素降解、纤维素降解、半纤维素降解方面具有明显优势。
[0089]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。