检测SARS-CoV-2的组合物及其试剂盒和应用的制作方法

本技术涉及核酸检测，尤其是涉及检测sars-cov-2的组合物及其试剂盒和应用。

背景技术：

1、sars-cov-2适应性突变的不断出现改变了病毒的致病性和传播性，并使其对当前的疫苗和抗病毒药物产生了耐药性。最近发现的名为omicron(b.1.1.529)的新型变异株具有高传染性和对当前疫苗和治疗性抗体的抵抗力，成为了世界卫生组织关注的变体(voc，variant of concern)。当前医疗保健系统的主要策略是通过及时发现潜在的covid-19感染和无症状携带者来控制。由于omicron的高传染性，医务人员经常面临大量样本的检测。快速准确的检测工具有助于遏制疫情。

2、研究者已开发了基于电化学和场效应晶体管(fet)技术的sars-cov-2抗原和抗体检测的不同方法。然而，蛋白靶标不易扩增，所以抗原/抗体检测高度依赖于受试者样本中靶标的表达量。因此，这类方法更适合抗原尚未被自身免疫清除的初始症状受试者。相比之下，核酸检测，如聚合酶链反应(pcr)被认为是早期诊断covid-19感染的金标准。但目前的pcr检测需要耗费大量的人力和较长的操作时间。为此，研究者探索了基于电化学、局部表面等离子共振(lspr)传感和环介导等温放大(lamp)技术的生物传感器来进行核酸检测。然而，这些方法有一些仅适用于单一目标表征，或开发方法比较复杂，不利于大规模展开检测。因此，有必要针对omicron变体设计兼具高灵敏度、低成本和操作简单等优点的检测试剂。

技术实现思路

1、本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种检测sars-cov-2的组合物及其试剂盒和应用，利于该组合物在针对sars-cov-2进行检测时，具有灵敏度高、制造成本低和操作简单等优势。

2、本技术的第一方面，提供一种检测sars-cov-2的组合物，该组合物包括：

3、二维纳米片；

4、核酸外切酶ⅲ；

5、第一探针，第一探针用于靶向sars-cov-2 omicron变体的n基因靶序列，n基因靶序列包括以下核苷酸序列：gatcgcgccgcaccattctgg(seq id no.1)；

6、第二探针，第二探针用于靶向sars-cov-2 omicron变体的s基因靶序列，s基因靶序列包括以下核苷酸序列：ggagatcttctggctcacgcactataat(seq id no.2)；

7、其中，第一探针和第二探针分别修饰有不同的荧光标记。

8、根据本技术实施例的组合物，至少具有如下有益效果：

9、该组合物基于荧光共振能量转移的原理设计，利用宽淬灭光谱和优异表面能量转移的二维纳米片作为淬灭剂，作为单链捕获探针的第一探针和第二探针在没有靶标的情况下，会被纳米片吸附，由于二维纳米片的光学吸收作用，使探针上的荧光标记通过荧光共振能量转移而淬灭。而在出现靶标后，第一探针和第二探针与靶序列杂交生成双链dna，该双链dna无法被二维纳米片吸附和淬灭。在这种情况下，利用核酸外切酶ⅲ特异性催化双链dna，使其沿3'到5'方向逐步去除单核苷酸，将探针的荧光标记从中释放，产生对应荧光；同时将靶标从双链中释放，然后反复结合更多的探针以放大信号。

10、此外，选取的第一探针和第二探针分别靶向sars-cov-2 omicron变体在n基因和s基因的特异性缺失位点，双靶标的检测方式满足实际的检测需求，同时，选择的两段靶序列在同步检测时不会发生相互干扰而影响检测结果的问题，使得最终检测结果具有良好的特异性和灵敏度，检测限在5pm左右。

11、上述实施方式中，荧光标记是指激发后能够发出荧光的化合物或其部分官能团，例如可以是荧光团。可以理解的是，在本技术实施例中，修饰有荧光标记的单链探针在二维纳米片作用下其荧光能够被淬灭。具体的，荧光标记可选fam、hex、tamra、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7、texax、rox、joe、r6g、edans以及其它一些本领域所指的荧光标记。不同的荧光标记是指激发波长(段)不同的荧光标记，以此可以分别单独检测第一探针和第二探针所靶向的n基因和s基因并进行综合。通常，核酸外切酶ⅲ为来源于e.coli的核酸外切酶ⅲ。

12、在本技术的一些实施方式中，sars-cov-2是指sars-cov-2病毒的omicron变异株，例如ba.1、ba.2、ba.4、ba.5、ba.2.12.1等。进一步，sars-cov-2是指omicron b.1.1.529变体。

13、在本技术的一些实施方式中，n基因靶序列如下所示：gatcgcgccgcaccattctgg(seq id no.1)；s基因靶序列如下所示：ggagatcttctggctcacgcactataat(seq id no.2)。

14、在本技术的一些实施方式中，第一探针和第二探针分别靶向包含如seq id no.1和2所示的靶序列，并在探针和靶序列结合后使双链暴露出3'钝性末端。

15、在本技术的一些实施方式中，第一探针包括以下核苷酸序列：atggtgcggcgcgatc(seq id no.3)，第二探针包括以下核苷酸序列：gtgcgtgagccagaagatctcc(seq id no.4)。

16、在本技术的一些实施方式中，第一探针的序列如下所示：atggtgcggcgcgatc(seqid no.3)，第二探针的序列如下所示：gtgcgtgagccagaagatctcc(seq id no.4)。

17、在本技术的一些实施方式中，荧光标记修饰于所述第一探针和所述第二探针的内部。实验过程中发现，在内部而非在3′端修饰荧光标记可以使得探针在检测时具有更高的荧光强度，检测的灵敏度和特异性也就更好。其中，内部是指荧光标记所修饰的核苷酸并非其3′端或5′端的第1个核苷酸。例如，假设探针包含n个核苷酸，修饰荧光标记的核苷酸为3′端的第a个和5′端的第n+1-a个核苷酸，同时满足a≥2且n+1-a≥2。进一步可以是a≥2、3、4、5、6、7、8、9、10等且n+1-a≥2、3、4、5、6、7、8、9、10等。具体的核苷酸修饰位点根据探针的长度可以自由选择。

18、在本技术的一些实施方式中，荧光标记分别独立修饰于第一探针和第二探针的5′端第4～8个核苷酸中的任一个。可以理解的是，荧光标记分别独立修饰于第一探针和第二探针的5′端第4～8个核苷酸中的任一个同样满足其不为3′端的第1个核苷酸。

19、在本技术的一些实施方式中，二维纳米片为ti3c2(ti3c2tx)纳米片。ti3c2纳米片具有良好的生物相容性、高荧光猝灭效率和宽吸收光谱，并且表面具有丰富的-f、-o和-oh官能团，可以有效地与许多生物分子相互作用。作为淬灭剂使用可以获得更好的检测效果，同时可以选择更广泛来源和波段的荧光标记。

20、在本技术的一些实施方式中，ti3c2纳米片由酸蚀(如氢氟酸)剥离max前体制得。max前体中，m为过渡金属(如ti)，a由al等ⅰ3和ⅰ4族元素，x为c。

21、在本技术的一些实施方式中，ti3c2纳米片由lif和hcl剥离ti3alc2制得。

22、在本技术的一些实施方式中，ti3c2纳米片的流体动力学尺寸分布约为460～615nm。

23、在本技术的一些实施方式中，ti3c2纳米片的厚度约为2～4nm。

24、在本技术的一些实施方式中，第一探针和二维纳米片的终浓度比例为20nm：(8～16)μg/ml，第二探针和二维纳米片的终浓度比例为20nm：(8～16)μg/ml。例如，第一探针/第二探针和二维纳米片的终浓度比例为20nm：8μg/ml、20nm：9μg/ml、20nm：10μg/ml、20nm：11μg/ml、20nm：12μg/ml、20nm：13μg/ml、20nm：14μg/ml、20nm：15μg/ml、20nm：16μg/ml。进一步的，第一探针/第二探针和二维纳米片的终浓度比例为20nm：(9～15)μg/ml、20nm：(10～14)μg/ml、20nm：(11～13)μg/ml。

25、在本技术的一些实施方式中，第一探针和核酸外切酶ⅲ的终浓度比例为20nm：(0.005～0.025)u/μl，第二探针和核酸外切酶ⅲ的终浓度比例为20nm：(0.005～0.025)u/μl。例如，第一探针/第二探针和核酸外切酶ⅲ的终浓度比例为20nm：0.005u/μl、20nm：0.01u/μl、20nm：0.015u/μl、20nm：0.02u/μl、20nm：0.025u/μl。进一步的，第一探针/第二探针和核酸外切酶ⅲ的终浓度比例为20nm：(0.01～0.025)u/μl、20nm：(0.01～0.020)u/μl、20nm：(0.015～0.025)u/μl、20nm：(0.015～0.02)u/μl。

26、在本技术的一些实施方式中，还包括tris-hcl缓冲液、ne缓冲液、含有1～20mmnacl的ne缓冲液。

27、在本技术的一些实施方式中，还包括tris-hcl缓冲液。不同缓冲体系中不同的探针与靶向片段反应的荧光信号强度有明显区别，在tris-hcl缓冲液中上述两种探针都显示出较强且稳定的荧光信号。因而采用tris-hcl缓冲体系提高反应中的荧光强度，从而提高检测灵敏度。

28、本技术的第二方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包括前述的组合物。利用该试剂盒可以对sars-cov-2 1.1.529omicron变体实现高灵敏度的检测。

29、在本技术的一些实施方式中，试剂盒中还包括阳性对照品(例如包含靶标的假病毒、重组质粒等其中至少一种)、阴性对照品(例如生理盐水等)中的至少一种。

30、在本技术的一些实施方式中，试剂盒中还包括rt-pcr试剂，包括rt-pcr反应液(包含组分如tris、dntps、mg2+、k+等其中至少一种)、rt-pcr酶(包含反转录酶、dna聚合酶等其中至少一种)。

31、本技术的第三方面，提供一种非诊断目的的检测样本中sars-cov-2 omicron变体的方法，该方法包括以下步骤：

32、提取样本中的核酸；

33、采用前述的组合物或试剂盒对所述核酸进行检测，根据检测结果分析sars-cov-2omicron变体的浓度。

34、在本技术的一些实施方式中，在检测前还包括将提取的核酸进行rt-pcr反应。

35、本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。