一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法与流程

1.本发明涉及寡肽制备技术领域，具体涉及一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法。


背景技术：

2.酪蛋白(casein，cn)是牛乳在20℃、ph4.6时沉淀下来的蛋白质，呈酸性，是一种含磷的蛋白质，是牛奶中含量最为丰富、对人类营养价值最高的蛋白质。酪蛋白分子质量大约为20～25kda，由四类遗传变种组成，为αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，含量比为3∶0.8∶3∶1。根据四种蛋白成分的氨基酸序列分析，β-酪蛋白含有1个ipp和1个vpp，κ则只含有1个ipp。
3.酪蛋白是牛奶中的主要过敏原。酪蛋白之所以是过敏原，是因为人乳与牛乳酪蛋白的组成和含量不同及其成分结构上的差异。酪蛋白中αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一个过敏原，β-酪蛋白是酪蛋白中过敏原性比较低的一种蛋白质。有报道称，酪蛋白水解产物的抗原性和过敏性部分取决于肽的分子量，然而又很难确定在什么限度下保证低抗原性和低过敏性。美国及欧盟国家有明确规定，如果食品中含有牛奶成分，就必须标出牛奶过敏原成分。
4.酪蛋白水解物具有ace酶抑制活性，能够阻断血管紧张素ii的生成，同时抑制缓激肽的降解，促使具有扩张血管作用的缓激肽生成。由于蛋白质、酶种类及酶解条件的不同，所得产物的氨基酸组成和结构差别很大，酶解产物成分非常复杂，且酶解过程中产生了很多相对分子质量相近的肽段。
5.专利cn100398661c公开了一种酪蛋白水解物，其制备方法是酪蛋白经过酶解，获得的酪蛋白水解物包括xaa pro及xaa pro pro，平均链长为2.1或以下，其具有ace抑制活性或降血压作用，但该专利酶解时间长，不经济环保，制得的寡肽中的活性三肽ipp和vpp含量较低，过敏原含量较高。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法。本发明以牛乳酪蛋白为原料，经酶解反应、膜过滤得到寡肽，活性三肽ipp(异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸)和vpp(缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸)含量分别为10.73％和1.92％，寡肽平均链长2.7以上，过敏原＜1ppm，具有较高的ace酶抑制活性；本发明工艺简单、酶解时间短、环保、经济。
7.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
8.一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法，包括如下步骤：
9.(1)以牛乳酪蛋白为原料，加入40～50倍量的纯化水，使用高压均质机进行均质，压力1000bar～1100bar，得到分散均匀的溶液；
10.(2)将溶液温度调节至48～52℃，向溶液中分别加入酪蛋白质量1％～2％的脯氨酸内切酶和酪蛋白质量0.05％～0.1％的风味蛋白酶，在48～52℃下反应40～60min，高温
灭活，浓缩，喷雾干燥，得寡肽。
11.优选地，所述步骤(1)中，所述压力为1060bar。
12.优选地，所述步骤(1)中，使用高压均质机进行均质时循环2次。
13.优选地，所述步骤(2)中，将溶液温度调节至50℃。
14.优选地，所述步骤(2)中，向溶液中分别加入酪蛋白质量1.5％的脯氨酸内切酶和酪蛋白质量0.1％的风味蛋白酶。
15.优选地，所述步骤(2)中，在50℃下反应50min。
16.优选地，所述步骤(2)中，在100℃下高温灭活15min。
17.一种寡肽，采用如上所述的一种牛乳酪蛋白水解制备寡肽的方法制备得到。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
19.(1)本发明以牛乳酪蛋白为原料，经酶解反应、膜过滤得到寡肽，经液相分析，活性三肽ipp含量为10.73％，vpp含量为1.92％，寡肽平均链长2.7以上，过敏原＜1ppm，制备得到的寡肽具有较高的ace酶抑制活性及低过敏原的特点；
20.(2)本发明工艺简单，酶解时间短，节能环保，高效易于操作，产品安全无过敏原，可添加到普通食品中。
附图说明
21.图1为本发明实施例1制得的寡肽的hplc图谱；
22.图2为本发明vpp标准品的hplc图谱；
23.图3为本发明ipp标准品的hplc图谱。
具体实施方式
24.为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
25.实施例1
26.取100g牛乳酪蛋白作为原料，加入5000ml的纯化水，通过高压均质机进行均质(压力1060bar)，循环2次，得到分散均匀的溶液；
27.将溶液温度调节至50℃，向溶液中加入组合酶，即脯氨酸内切酶和风味蛋白酶，其中脯氨酸内切酶的质量是酪蛋白质量的1.5％，风味蛋白酶的质量是酪蛋白质量的0.1％，在50℃下搅拌反应50min，在100℃下高温灭活15min，浓缩后喷雾干燥，得寡肽。
28.经液相法检测寡肽中的ipp和vpp的含量(本实施例制得的寡肽的hplc图谱见图1)，测定寡肽平均链长，用elisa(酶联免疫吸附试验)检测过敏原含量。
29.其中，所述酪蛋白来自华羚乳品股份有限公司；所述脯氨酸内切酶为黑曲霉的蛋白酶，来自宁波希诺亚海洋生物科技有限公司；所述风味蛋白酶为米曲霉的蛋白酶，来自北京索莱宝科技有限公司。
30.对比例1
31.取100g牛乳酪蛋白作为原料，加入5000ml纯化水，将溶液温度调节至50℃，向溶液
中加入组合酶，即脯氨酸内切酶和风味蛋白酶，其中脯氨酸内切酶的质量是酪蛋白质量的1.5％，风味蛋白酶的质量是酪蛋白质量的0.1％，在50℃下搅拌反应50min，在100℃下高温灭活15min，浓缩后喷雾干燥，得寡肽。
32.经液相法检测寡肽中的ipp和vpp的含量，测定寡肽平均链长，用elisa(酶联免疫吸附试验)检测过敏原含量。
33.其中，所述酪蛋白来自华羚乳品股份有限公司；所述脯氨酸内切酶为黑曲霉的蛋白酶，来自宁波希诺亚海洋生物科技有限公司；所述风味蛋白酶为米曲霉的蛋白酶，来自北京索莱宝科技有限公司。
34.对比例2～11
35.取100g牛乳酪蛋白作为原料，加入5000ml的纯化水，通过高压均质机进行均质(压力1060bar)，循环2次，得到分散均匀的溶液；
36.将溶液温度调节至50℃，分别向溶液中加入表1所述酶类，使其质量是酪蛋白质量的1.5％(或按照组合添加量添加)，在50℃下搅拌反应50min，在100℃下高温灭活15min，浓缩后喷雾干燥，得寡肽。
37.经液相法检测寡肽中的ipp和vpp的含量，测定寡肽平均链长，用elisa(酶联免疫吸附试验)检测过敏原含量。
38.其中，所述酪蛋白来自华羚乳品股份有限公司。
39.表1对比例2～11添加的酶的名称及其来源
[0040][0041][0042]
其中，表1所述脯氨酸内切酶来自宁波希诺亚海洋生物科技有限公司；所述木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶来自北京索莱宝科技有限公司；所述蛋白酶ap、multifect pr、蛋白酶pal来自杰能科生物工程有限公司。
[0043]
实施例1及对比例1～11制得的寡肽的成分检测结果见表2。
[0044]
表2实施例1及对比例1～11制得的寡肽的成分检测结果
[0045][0046][0047]
注：专利1为根据现有专利号cn100398661c制备的样品
[0048]
ipp和vpp含量的检测方法：
[0049]
取制备的样品10mg溶于1.0ml蒸馏水，涡旋混匀，过滤，分别以1mg/ml的vpp和ipp作为标准对照(vpp标准品及ipp标准品的hplc图谱分别见图2及图3)，按照如下条件检测：
[0050]
流动相a：0.1％甲酸-水；流动相b：0.1％甲酸-乙腈；
[0051]
色谱柱：c18，250
×
4.6mm，5μm；
[0052]
柱温：40℃；
[0053]
吸光度：214nm，流速：1.0ml/min；
[0054]
洗脱梯度：
[0055]
time/mina/％b/％09551590103050503550504095555955
[0056]
计算方法：含量(％)＝(a样品/a标品)
×
(c标品浓度/c样品浓度)
×
100％。
[0057]
平均链长测定：
[0058]
将40mg邻苯二醛溶解在1ml甲醇中，并加入100μl β-巯基乙醇；使用预先混有2.5ml 20％十二烷基硫酸钠的25ml 100mm四硼酸钠溶液，将邻苯二醛稀释至25ml，并进一步使用蒸馏水稀释至50ml以制备opa试剂。
[0059]
取酪蛋白酶水解物的粉末样品1g，溶于100ml，并于15000rpm离心10min，取出50μl上清。加入1ml已制备的opa试剂，剧烈振荡，置于室温下5min；使用吸收光度计测定340nm的吸光度。
[0060]
取酪蛋白酸水解物1g，溶于100ml，使用相同的方法进行测定以获得标准曲线，从中可判定吸光度与摩尔浓度之间的关系，根据公式计算平均链长：
[0061]
平均链长＝(酪蛋白酸水解物的摩尔浓度)/(酪蛋白酶水解物样品的摩尔浓度)。
[0062]
表3实施例1及对比例1～11制得的寡肽的ace酶抑制率测定结果
[0063][0064]
注：专利1为根据现有专利号cn100398661c制备的样品
[0065]
ace酶活抑制实验：
[0066]
取2ml离心管，加100μl hhl(马尿酰组胺酰亮氨酸)溶液(5mmol/l)和40μl样品，充
分振荡混匀，37℃孵育3min；再加入10μlace溶液(0.1u/ml)，混匀后37℃孵育30min，再加入150μl hcl(1mol/l)终止反应；再加入1.7ml乙酸乙酯，经振荡混匀后静置5min；吸取1ml乙酸乙酯至新的1.5ml离心管，离心管置于100℃金属浴中，烘干乙酸乙酯；最后加入1ml蒸馏水混匀后在228nm处测定吸光度。
[0067]
空白处理组：100μl hhl溶液(5mmol/l)+40μl样品，充分振荡混匀，37℃孵育3min；再加入10μl ace溶液(0.1u/ml)和150μlhcl(1mol/l)，混匀后37℃孵育30min；后续步骤同上。
[0068]
对照组：用等体积含0.3mol/l nacl的0.1mol/l硼酸盐缓冲液(ph8.3)代替样品；以对照组的ace酶活记为100％，抑制率为0％。
[0069]
按照以下公式计算样品对ace酶的抑制率(％)：
[0070]
抑制率(％)＝(abs对照组-abs样品组)/abs对照组
×
100％。
[0071]
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。