一种重组腺相关病毒载体及其应用的制作方法

本发明属于分子生物，具体涉及一种重组腺相关病毒载体及其应用。

背景技术：

1、腺相关病毒(aav)是细小病毒科的一种。aav基因组由一个长度约为4.7kb的线性单链dna分子组成，具有两个主要的开放阅读框，编码非结构复制和结构帽(衣壳)蛋白。aav编码区两侧是两个顺式作用的反向末端重复序列(itr)，长度约为145个核苷酸，在dna复制起始阶段起引物的作用。itr序列除了在dna复制中发挥作用外，还被证明在病毒整合、将病毒核酸包封到成熟的病毒粒子中等过程中起作用。引导病毒dna复制(rep)、包封/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在itr中。cap基因从p40启动子中表达，编码三种衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。衣壳蛋白由cap基因编码，根据cap基因的不同，aav具有多种血清型，并提供不同的组织倾向性。aav有多种血清型，包括:aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11等。其中aav9及其突变体aavphp.eb和aavphp.b被用在靶向中枢神经系统内的细胞递送中，用于治疗神经退行性疾病。

2、aav载体对于体内递送遗传物质有很大潜力，因为(i)它们能够感染(转导)各种非分裂和分裂细胞类型，包括肌纤维和神经元；(ii)它们没有病毒结构基因，从而消除了宿主细胞对病毒感染的自然反应，例如干扰素介导的反应；(iii)野生型病毒从未与人类的任何病理有关；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组的野生型aav不同，复制缺陷的aav载体通常以游离体形式存在，从而限制了插入突变或致癌基因激活的风险；(v)与其他载体系统相比，aav载体不会引发显著的免疫反应，因此能够长期表达治疗性转基因(前提是其基因产物不被排斥)。

3、脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,sma)是由5q13染色体存活运动神经元1基因(survival motor neuron 1gene,smn1)缺失或突变引起的一种神经遗传性疾病，导致smn蛋白水平降低，导致运动神经元选择性功能障碍。sma是一种常染色体隐性的早期儿童疾病，发病率为1:10 000。人类也携带着另一种与smn1几乎完全相同的基因，称为smn2。smn1和smn2基因均表达smn蛋白，但smn2产生的功能性全长蛋白数量远少于smn1(10～15％)。虽然smn2不能完全弥补smn1基因的缺失，但轻度sma患者通常具有较高的smn2拷贝数。2拷贝smn2可以97％预测发生i型sma,3拷贝smn2可以83％预测发生ii型sma,4拷贝smn2可以84％预测发生iii型sma。由于这些百分比不能反映修饰基因突变的可能影响，它们可能低估了拷贝数(在缺乏遗传修饰基因的情况下)和临床表型之间的关系。

4、i型sma是遗传疾病导致婴儿死亡的主要原因。疾病的严重程度和临床预后取决于smn2的拷贝数。在其最常见和最严重的形式(i型)中，张力减退和渐进性虚弱在出生后的头几个月被发现，6个月左右被诊断，然后在2岁左右多死于呼吸衰竭。i型sma的运动神经元丢失在出生后早期严重(甚至可能在产前就开始)，患者从未获得独立的坐姿。i型sma患者通常有1或2个smn2基因拷贝。相比之下，ii型sma在头18个月内出现，患有这种疾病的儿童能够独自坐着，但不能独立行走。ii型sma患者通常有3个smn2基因拷贝。sma iii型患者获得独立行走的能力。ii型和iii型sma患者的运动神经元似乎在发育过程中适应和补偿，并坚持到成年。iii型sma患者通常有3或4个smn2基因拷贝。ii型和iii型sma患者的临床病程相对稳定。此外，研究表明，结果差异与smn2拷贝的数量有关，smn2使运动神经元在儿童成长过程中能够适应和补偿，并持续到成年。这与i型sma不同，在出生后早期运动神经元严重缺失(甚至可能在产前就开始，特别是对于出生后三个月出现的i型sma患者)。在小鼠和非人类灵长类动物中，smn的过表达被证明是耐受良好的，而在人类中，smn2的高拷贝数不构成风险(正如在ii、iii和iv型患者中看到的，他们有较高的smn2拷贝数)。到目前为止，sma的治疗研究进展，尤其是ii型和iii型sma，主要集中在利用小分子增加smn水平方面。这些药物包括去乙酰化酶抑制剂，如丙戊酸、丁酸钠、丁酸苯酯和曲黴素a。这些药物激活smn2启动子，导致sma动物模型中全长smn蛋白增加，目的是改变疾病表型，使其具有iii型sma患者中所见的更温和的特征。

5、目前，进入临床试验阶段的药物包括苯基丁酸、丙戊酸和羟基脲等，但并没有产生足够的临床效益。fda批准的诺西那生钠(spinraza)，一种反义寡核苷酸(aso)药物，旨在通过调节smn2基因的剪接来增加全长smn蛋白的产量，从而弥补潜在的遗传缺陷。临床研究显示，有望改善运动障碍；然而，这种治疗方法必须通过鞘内注射无限期地给药，在生效前需要很长的诱导期，并有需要临床监测的安全性考虑。fda批准的zolgensma就是通过aav9载体将自身互补的双链smn1表达序列递送到体内，并在受到巨细胞病毒(cmv)即刻/早期增强子和鸡β-肌动蛋白(cb)启动子的调控作用下已达到治疗的目的，但就目前的临床数据来看，针对sma患者治疗效果有待提升。

技术实现思路

1、本发明第一个方面的目的，在于提供一种重组腺相关病毒载体。

2、本发明的第二方面的目的，在于提供一种药物组合物。

3、本发明的第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的重组腺相关病毒载体、第二方面的药物组合物的应用。

4、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

5、本发明的第一个方面，提供一种重组腺相关病毒(aav)载体，包含腺相关病毒(aav)衣壳和非自身互补的单链基因组；所述单链基因组包含ef1α启动子和编码运动神经元存活(smn)蛋白的基因。

6、优选地，所述腺相关病毒(aav)衣壳为aavphp.eb、aavphp.b和aav9衣壳中的一种；进一步为aav9衣壳。

7、优选地，所述ef1α启动子为(a1)～(a3)中任一种：

8、(a1)具有如seq id no.1所示核苷酸序列的启动子；

9、(a2)seq id no.1所示核苷酸序列经过一个或多个碱基的取代、缺失或添加后仍具有ef1α启动子功能的核苷酸序列所示的启动子；

10、(a3)与seq id no.1所示核苷酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性且具有ef1α启动子功能的核苷酸序列所示的启动子。

11、优选地，所述运动神经元存活(smn)蛋白为人运动神经元存活(smn)蛋白。

12、优选地，所述运动神经元存活(smn)蛋白为(b1)～(b3)中任一种：

13、(b1)具有如seq id no.2所示氨基酸序列的蛋白；

14、(b2)seq id no.2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加后仍具有运动神经元存活蛋白功能的氨基酸序列所示的蛋白；

15、(b3)与seq id no.2所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性且具有运动神经元存活蛋白功能的氨基酸序列所示的蛋白；

16、其中，seq id no.2为：mamssggsgggvpeqedsvlfrrgtgqsddsdiwddtalikaydkavasfkhalkngdicetsgkpkttpkrkpakknksqkkntaaslqqwkvgdkcsaiwsedgciypatiasidfkretcvvvytgygnreeqnlsdllspicevannieqnaqenenesqvstdesensrspgnksdnikpksapwnsflpppppmpgprlgpgkpglkfngpppppppppphllscwlppfpsgppiipppppicpdslddadalgsmliswymsgyhtgyymgfrqnqkegrcshsln。

17、进一步优选地，所述编码运动神经元存活(smn)蛋白的基因为人smn1基因(nm_000344)。

18、优选地，所述单链基因组还包含：wpre。

19、优选地，所述单链基因组还包含：kozak序列、聚腺苷酸(polya)、aav反向末端重复(itrs)序列中的至少一种。

20、进一步优选地，所述单链基因组还包含kozak序列、聚腺苷酸(polya)、wpre和aav反向末端重复(itrs)序列。

21、优选地，所述aav反向末端重复(itrs)序列包含aav 5’-itr和aav3’-itr。

22、优选地，所述聚腺苷酸为bgh聚腺苷酸(polya)。

23、优选地，一种重组腺相关病毒(aav)载体，包含腺相关病毒(aav)衣壳和非自身互补的单链基因组；所述单链基因组包含aav 5’-itr、ef1α启动子、kozak序列、编码运动神经元存活(smn)蛋白的基因、聚腺苷酸(polya)、wpre和aav3’-itr。

24、本发明的第二个方面，提供一种药物组合物，包含本发明第一方面的重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体/赋形剂。

25、本发明的第三个方面，提供(1)～(2)中任一项中在制备预防、减轻或治疗神经系统疾病的药物中的应用：

26、(1)本发明第一方面的重组腺相关病毒载体；

27、(2)本发明第二方面的药物组合物。

28、优选地，所述神经系统疾病为涉及运动功能的运动神经元疾病。

29、优选地，所述运动神经元疾病选自脊髓性肌萎缩(sma)、肌萎缩性侧索硬化症(als)、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化(pls)和外伤性脊髓损伤中的至少一种；进一步为脊髓性肌萎缩(sma)。

30、优选地，所述脊髓性肌萎缩(sma)包括i型脊髓性肌萎缩(sma)、ii型脊髓性肌萎缩(sma)、iii型脊髓性肌萎缩(sma)和iv型脊髓性肌萎缩(sma)。

31、优选地，所述药物的给药方式为注射。

32、优选地，所述注射为静脉注射、脑室注射和鞘内注射中的至少一种；进一步为脑室注射。

33、本发明的有益效果是：

34、本发明提供了提供一种重组腺相关病毒(aav)载体，包含腺相关病毒(aav)衣壳和非自身互补的单链基因组；所述单链基因组包含ef1α启动子和编码运动神经元存活(smn)蛋白的基因；现有的针对sma的基因治疗药物或策略，多使用全时段广泛性表达的启动子，尤其是基于cmv(human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter,人巨细胞病毒即刻早期增强型启动子)启动子衍生出的cb系列启动子或者cag系列启动子，这些启动子可以让其所控制的人smn1基因序列在体内一直保持高水平表达，本发明通过采用ef1α启动子，调控smn1基因表达，在sma患者发育成型后不再保持smn基因的持续性高表达，避免出现由于smn持续性过表达引起的运动神经元延迟性退行性病变，使得本发明提供的重组腺相关病毒(aav)载体治疗sma的效果显著优于包含其他启动子的重组腺相关病毒(aav)载体：延长小鼠生存时间、增加小鼠体重、改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育，可用于预防、减轻或治疗神经系统疾病。

35、本发明通过限定aav病毒载体血清型，实现将非自身互补的单链基因组高效地转运至目标器官和组织。