用于检测MON87712转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及方法与流程

本发明属于分子生物学，尤其涉及一种用于检测mon87712转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术：

1、植物转基因，是将人工分离和修饰过的外源基因导入到需要改良的植物体中，使之产生新的性状，从而达到改良生物的目的。通过转基因技术可培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等特性的作物新品种，以减少对农药、化肥和水的依赖，降低农业成本，大幅度地提高单位面积的产量，改善食品的质量，缓解世界粮食短缺的矛盾。

2、但伴随着转基因商业化的迅猛发展，有关转基因食品安全性的争论备受关注，呈现愈演愈烈的趋势。争议的焦点主要集中在5个方面：毒性问题，过敏反应、营养问题、对抗生素的抵抗作用和对环境的威胁。我国对农业转基因生物实施“零容忍”态度，实行强制标识管理。解决标识最核心的问题就是如何准确、精确地确定转基因动植物的外源基因拷贝数及含量，考虑到转基因低水平混杂等客观实际，因此开展转基因成分定量检测方法的研究及应用，已经成为现今转基因产品检测技术研究的一个关键点，具有重要的科学和现实意义。转基因大豆作为转基因农产品的重要组成部分，通过对转基因大豆进行有效的监管，对于保障我国的食用安全、饲用安全和环境安全具有重要的意义。

3、而转基因大豆品系mon87712作为转基因大豆的重要品系，本发明希望提出一种可高效、准确、快速检测mon87712转基因大豆品系的技术方法，以用于保障我国大豆产业安全。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测mon87712转基因大豆品系的引物、探针、试剂盒及方法。本发明基于mon87712转基因大豆边界序列进行引物和探针的设计，所建立的检测方法具有高效、准确、快速的特点，能够应用于mon87712转基因大豆品系及其产品的定量检测，为检验监管工作和相关部门行政执法提供强有力的支撑，并为规范相关企业的生产行为和保障我国粮食安全等方面具有重大的意义。

2、本发明提供了一种用于检测mon87712转基因大豆品系的引物，所述引物的核苷酸序列为：

3、mon87712-f：5’-atgtgagtacattctcgagcag-3’(seq id no：1)，

4、mon87712-r：5’-tgaaggcgggaaacgacaatc-3’(seq id no：2)。

5、本发明还提供了一种用于检测mon87751转基因大豆品系的探针，所述探针的核苷酸序列为：

6、mon87712-p：5-acctgcagaagctagcttgatgggga-3’(seq id no：3)。

7、优选地，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。所述荧光基团包括但不限于fam、tet、hex、cy3或joe，所述淬灭基团包括但不限于bhq1、bhq2、tamra、dabcyl、mgb或eclipse。

8、本发明还提供一种用于检测转基因大豆品系的试剂盒，包括上述用于检测转基因大豆品系的引物和上述用于检测转基因大豆品系的探针。

9、优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因lectin的引物和探针。

10、更优选地，所述检测内参基因lectin的引物，其核苷酸序列为：

11、lectin-f：5’-cgcttccttcaacttcaccttc-3’(seq id no：4)，

12、lectin-r：5’-cttagtgtcaattggtgcgaga-3(seq id no：5)。

13、所述检测内参基因lectin的探针，其核苷酸序列为：

14、lectin-p：5’-agaaggcaagcccatctgcaagcct-3’(seq id no：6)。

15、所述检测内参基因lectin的探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团，但其所用荧光基团与用于检测mon87712转基因大豆品系的探针不相同。

16、本发明还提供了一种用于检测转基因大豆品系的方法，采用上述用于检测转基因大豆品系的试剂盒中的引物和探针进行检测，所述检测方法选自荧光定量pcr检测、微滴式数字pcr检测、基因芯片检测或等温核酸扩增检测。

17、优选地，当所述检测方法为微滴式数字pcr检测时，包括以下步骤：

18、(1)提取样品dna；

19、(2)以所述样品dna为模板，加入引物和探针、ddpcr super mix和蒸馏水，得到反应体系；

20、(3)将步骤(2)配制的反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴发生器中生成微滴；

21、(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析。

22、更优选地，所述提取样品dna的方法为改良ctab-磁珠法，所述改良ctab-磁珠法包括以下步骤：

23、(1)在样品中加入ctab裂解液进行处理，取上清液备用；

24、(2)在五联管中从左往右依次加入以下试剂：第一管中加入上清液、磁珠吸附缓冲液和磁珠悬浮液；第二管中加入上清液、磁珠吸附缓冲液；第三管和第四管中分别加入酒精；第五管中加入ddh2o；

25、(3)对第一管中液体震荡混匀，取磁珠；转移磁珠至第二管中，震荡混匀，取磁珠；转移磁珠至第三管中，震荡混匀，取磁珠；转移磁珠至第四管中，震荡混匀，取磁珠并干燥；转移磁珠至第五管中，震荡混匀，第五管剩余溶液即为样品dna溶液。

26、本发明通过改良ctab核酸提取方法，将ctab和纳米磁珠结合，建立磁珠法全自动核酸提取深加工农产品中dna的方法，实现了核酸提取自动化，提取的核酸浓度高、质量好，无pcr抑制物，核酸质量优于传统的ctab法和sds法，解决了复杂样品中转基因成分检测的瓶颈问题。

27、更优选地，步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddpcr super mix 10μl、每种上游引物1μl、每种下游引物1μl、每种探针1μl、样品dna 2μl、采用灭菌蒸馏水补足至20μl。

28、进一步优选地，步骤(2)中每种上游引物在反应体系的终浓度为600-1200nmol/l，每种引物在反应体系的终浓度为600-1200nmol/l，每种探针在反应体系的终浓度为150-400nmol/l。

29、更优选地，步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃保持10min使酶失活。

30、相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

31、(1)植物产品dna的提取常采用的方法是ctab法或sds法，两种方法共同特点是操作步骤繁琐，费时费力，而且苯酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂有损操作者健康。针对此类产品核酸提取的难题，本发明采用了一种改良的ctab-磁珠提取方法，该方法操作步骤简单快捷，并且避免使用有毒的苯酚等试剂，省去了离心步骤，高效安全，适用于大批量样品核酸的提取，解决了高质量核酸提取的瓶颈问题。

32、(2)本发明通过分析mon87712转基因大豆品系边界序列，结合内源标记基因的使用情况，筛选得到特异性的引物和探针。并基于双重微滴式数字pcr方法，建立了高效、准确、快速的转基因大豆品系定量检测方法，检测下限可达0.005ng/μl，为检验监管工作和有关部门决策提供切实可靠的科学依据和技术支撑，对提升转基因定量检测能力，规范大豆企业的生产行为，保障我国大豆产业安全，保障大豆进出口安全，避免产品因转基因含量超标造成退货或销毁等方面都具有重要的意义。