一种巨噬细胞消化液及专用于巨噬细胞的消化方法与流程

1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种巨噬细胞消化液及专用于巨噬细胞的消化方法。


背景技术：

2.巨噬细胞是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫和特异性防卫。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。
3.骨髓来源的巨噬细胞和巨噬细胞系raw264.7均是免疫等科学研究常用细胞。在巨噬细胞体外培养中，主要有三种类型：未分化状态（m0）、经典型巨噬细胞（m1）和替代型巨噬细胞（m2），后两种状态为分化状态。在进行传代培养的过程中，需要消化巨噬细胞。而消化过程中，巨噬细胞对外界刺激较为敏感，容易分化，过强的机械刺激（比如吹打）或者酶消化，均容易诱导处于m0状态的巨噬细胞分化，巨噬细胞的分化是一个困扰巨噬细胞培养的大问题。
4.胰酶消化巨噬细胞，需要严格控制消化时间30-60秒以内，而且吹打需要非常轻柔，否则容易引起巨噬细胞分化，这个过程非常需要经验和技巧，新手很难上手，学习难度大，很容易导致出现分化，消化率不高。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种巨噬细胞消化液及专用于巨噬细胞的消化方法，消化时间和吹打力度不用十分严格的限制，更易于操作，提高消化率，降低分化率。
6.本发明通过下述技术方案实现：一种巨噬细胞消化液，按重量份数计，包括下列组份：乙二胺四乙酸（edta）3-6份、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)4-8份、胎牛血清8-12份和磷酸缓冲缓冲液（pbs缓冲液）90-100份。
7.进一步，按重量份数计，包括下列组份：乙二胺四乙酸（edta）4份、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)6份、胎牛血清10份和磷酸缓冲缓冲液（pbs缓冲液）95份。
8.进一步，所述全部组份混合后用0.20-0.25μm口径的无菌针头过滤器过滤，过滤后2-6℃下保存6个月，然后得到本发明巨噬细胞消化液。
9.进一步，所述无菌针头过滤器的口径为0.22μm。
10.进一步，所述过滤后的温度为4℃。
11.一种专用于巨噬细胞的消化方法，使用上述巨噬细胞消化液，消化方法包括如下步骤：巨噬细胞消化液的制备：将乙二胺四乙酸（edta）、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)和胎牛血清用磷酸缓冲缓冲液（pbs缓冲液）配置成消化液原液，然后将消化液原
液用无菌针头过滤器过滤，过滤后低温保存6个月，然后得到巨噬细胞消化液；消化液的加入：将巨噬细胞培养瓶中加入巨噬细胞消化液，巨噬细胞培养瓶的规格体积与巨噬细胞消化液的体积之比为25:1；消化液的混合：将加入巨噬细胞消化液的巨噬细胞培养瓶摇晃，使得巨噬细胞消化液均匀覆盖培养瓶，静置1-2分钟，直至巨噬细胞消化液中有漂浮的脱落巨噬细胞；中和：将dmem培养基加入到静置后的巨噬细胞培养瓶中，对巨噬细胞消化液进行中和，将细胞吹打下来，吹散细胞，转移到离心管中，此步骤中，所述dmem培养基的体积与巨噬细胞消化液的体积之比为3-5:1；离心：将转移到离心管中的溶液进行室温离心3min；接种：离心后，在离心管中加入dmem培养基，此步骤中，所述dmem培养基的体积与离心管中的溶液的体积之比为1:1，然后将离心管中的溶液接种到培养瓶，完成巨噬细胞的消化。
12.进一步，所述离心步骤中，离心速度为800rpm。
13.进一步，所述中和步骤和接种步骤中，dmem培养基含有10％胎牛血清和1％的青链霉素混合液（双抗）。
14.上述至少包括以下优点：1、本发明一种巨噬细胞消化液及专用于巨噬细胞的消化方法，本消化液没有依靠胰酶来消化，没有胰酶对巨噬细胞损伤作用，而利用edta和egta的螯合作用，螯合细胞培养基中的ca
2+
离子，两种螯合剂浓度合适，一起联用效果较好；2、本发明一种巨噬细胞消化液及专用于巨噬细胞的消化方法，dmem培养基含有胎牛血清，减少吹打对细胞的机械损伤，同时，有这些血清存在也有利于在消化过程中维持细胞活力，所以本发明消化时，对吹打的轻柔程度要求没有胰酶消化时那么严格；3、本发明一种巨噬细胞消化液及专用于巨噬细胞的消化方法，在消化时，消化时间可以在1-2分钟，与现有的胰酶消化相比，限制较小，吹打也不需要非常轻柔，更易于操作，学习难度小，同时，本消化液对巨噬细胞进行消化，消化率高，降低了巨噬细胞的分化率。
附图说明
15.此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：图1为巨噬细胞m0状态形态图；图2为巨噬细胞m1状态形态图；图3为巨噬细胞m2状态形态图；图4为巨噬细胞凋亡细胞和焦亡细胞形态图；图5为巨噬细胞系raw264.7分化状态形态图；图6为巨噬细胞系raw264.7采用本发明消化液和消化方法后的形态图。
具体实施方式
16.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本
发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例
17.在一个实施例中，一种巨噬细胞消化液，按重量份数计，包括下列组份：乙二胺四乙酸（edta）3-6份、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)4-8份、胎牛血清8-12份和磷酸缓冲缓冲液（pbs缓冲液）90-100份。
18.在一个实施例中，按重量份数计，包括下列组份：乙二胺四乙酸（edta）4份、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)6份、胎牛血清10份和磷酸缓冲缓冲液（pbs缓冲液）95份。
19.在一个实施例中，所述全部组份混合后用0.20-0.25μm口径的无菌针头过滤器过滤，过滤后2-6℃下保存6个月，然后得到本发明巨噬细胞消化液。
20.在一个实施例中，所述无菌针头过滤器的口径为0.22μm。
21.在一个实施例中，所述过滤后的温度为4℃。
22.在一个实施例中，一种专用于巨噬细胞的消化方法，使用上述的巨噬细胞消化液，消化方法包括如下步骤：巨噬细胞消化液的制备：将乙二胺四乙酸（edta）、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)胎牛血清用磷酸缓冲缓冲液（pbs缓冲液）配置成消化液原液，然后将消化液原液用无菌针头过滤器过滤，过滤后低温保存6个月，然后得到巨噬细胞消化液；消化液的加入：将巨噬细胞培养瓶中加入巨噬细胞消化液，巨噬细胞培养瓶的规格体积与巨噬细胞消化液的体积之比为25:1；消化液的混合：将加入巨噬细胞消化液的巨噬细胞培养瓶摇晃，使得巨噬细胞消化液均匀覆盖培养瓶，静置1-2分钟，直至巨噬细胞消化液中有漂浮的脱落巨噬细胞；中和：将dmem培养基加入到静置后的巨噬细胞培养瓶中，对巨噬细胞消化液进行中和，将细胞吹打下来，吹散细胞，转移到离心管中，此步骤中，所述dmem培养基的体积与巨噬细胞消化液的体积之比为3-5:1；离心：将转移到离心管中的溶液进行室温离心3min；接种：离心后，在离心管中加入dmem培养基，此步骤中，所述dmem培养基的体积与离心管中的溶液的体积之比为1:1，然后将离心管中的溶液接种到培养瓶，完成巨噬细胞的消化。
23.在一个实施例中，所述离心步骤中，离心速度为800rpm。
24.在一个实施例中，所述中和步骤和接种步骤中，dmem培养基含有10％胎牛血清和1％的青链霉素混合液（双抗）。
25.实验例原材料的选取：edta采用生工生物工程(上海)股份有限公司的产品（标号：e0322-100g）、egta采用生工生物工程(上海)股份有限公司的产品（标号：ed0077-25g）、胎牛血清采用gibco公司的产品（标号：10100147）、dmem采用gibco公司的高糖型产品（标号：11995065）、青链霉素混合液（双抗）采用碧云天生物技术研究所的产品（标号：st488）、磷酸缓冲缓冲液（pbs缓冲液）采用北京索莱宝科技有限公司产品（标号：p1010），以上原材料均为现有产品。
26.实验仪器：25cm2培养瓶（25cm2指培养瓶中细胞生长面的底面积）、离心管、离心机、细胞培养箱、超净工作台、枪头、加样枪、普通倒置光学显微镜，上述实验仪器均为现有通用仪器。
27.巨噬细胞消化液实验组份的选取：巨噬细胞消化液实验组份选取优选组份配比，按重量份数计，包括下列组份：乙二胺四乙酸（edta）4份、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)6份、胎牛血清10份和磷酸缓冲缓冲液（pbs缓冲液）95份。
28.实验操作：巨噬细胞消化液的制备：将0.04g乙二胺四乙酸（edta）、0.06g乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)和0.1g胎牛血清用0.95g磷酸缓冲缓冲液（pbs缓冲液）配置成消化液原液，然后将消化液原液用无菌针头过滤器过滤，过滤后低温保存6个月，然后得到巨噬细胞消化液；消化液的加入：将25cm2规格的巨噬细胞培养瓶中加入巨噬细胞消化液，巨噬细胞培养瓶的规格体积与巨噬细胞消化液的体积之比为25:1；消化液的混合：将加入巨噬细胞消化液的巨噬细胞培养瓶摇晃，使得巨噬细胞消化液均匀覆盖培养瓶，静置1-2分钟，直至巨噬细胞消化液中有漂浮的脱落巨噬细胞；中和：将dmem培养基加入到静置后的巨噬细胞培养瓶中，对巨噬细胞消化液进行中和，将细胞吹打下来，吹散细胞，转移到离心管中，此步骤中，所述dmem培养基的体积与巨噬细胞消化液的体积之比为3-5:1；离心：将转移到离心管中的溶液进行室温离心3min；接种：离心后，在离心管中加入dmem培养基，此步骤中，所述dmem培养基的体积与离心管中的溶液的体积之比为1:1，然后将离心管中的溶液接种到培养瓶，完成巨噬细胞的消化。
29.更具体地，所述离心步骤中，离心速度为800rpm。
30.更具体地，所述中和步骤和接种步骤中，dmem培养基含有10％胎牛血清和1％的青链霉素混合液（双抗）。
31.判断依据：公司对现有巨噬细胞体外培养中，主要有三种类型的形态通过光学显微镜观察，并对特点进行说明，以下为具体的记录，并给出了附图1-4：m0：主要是圆球形或者边缘有点点凹凸的圆球形（见附图1），可以认为是单核细胞或者类似于单核细胞，代谢方式是有氧糖酵解（特点：耗氧和耗糖快，且产酸少，培养基变色慢，细胞长满后培养颜色不变或者稍黄）。
32.m1：主要是多个长凸起的不规则形，细胞面积比m2和m0大，折光性稍低，细胞更扁平，细胞核更大，细胞内容物更多（见附图2），因为功能是杀菌，杀肿瘤为主，调节为辅，经典理论认为是促炎作用，代谢方式是有氧糖酵解（特点：耗糖快，产物中乳酸较多，培养基变色非常明显，一般没有长满就已经变黄了）。
33.m2：主要是有少量长凸起的圆球形或者椭圆形或者长梭形（见附图3），功能是以免疫调节为主，经典理论认为是抗炎作用，代谢方式是氧化磷酸化（特点：类似于m0，但耗氧稍快，产物中co2较多，比m0稍酸，培养基稍黄一点）。
34.m0是未分化的巨噬细胞；m1和m2型巨噬细胞是已经分化的巨噬细胞，m1是经典型巨噬细胞，m2是替代型巨噬细胞。
35.研究的目标细胞系：为巨噬细胞系raw264.7，巨噬细胞系raw264.7的分化状态通
过光学显微镜观察，如附图5，用传统胰酶消化后的巨噬细胞系raw264.7的形态，可以观察到较大比例的巨噬细胞已经分化。
36.采用上述实验组份和实验方法进行实验，巨噬细胞系raw264.7采用本发明消化液进行消化，通过光学显微镜观察，如附图6，测定单位面积未分化的巨噬细胞的比例，可以观察到巨噬细胞几乎没有分化，几乎全部处于未分化的m0状态，截取的面积和区域会导致有一定的偏差，通过若干组实验可大大降低这种偏差，现有胰酶消化的实验条件与本发明实验条件一致，形成对比。
37.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。