伏马毒素人工抗原及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于免疫化学技术领域，更具体地说，涉及伏马毒素人工抗原，本发明还是涉及该抗原的制备方法与应用。


背景技术：

2.伏马菌素(fumonisin)主要是由串珠镰刀菌属产生的一类有毒害和致癌性的真菌毒素，主要污染玉米、小麦、稻米等粮食作物及其制品，伏马毒素为自然产生，食用含有伏马毒素的食品后可引起人类或动物的脑白质软化症、肺水肿症候群以及人类食道癌等人畜疾病有关。另外，伏马毒素还是一种慢性促癌剂，能引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变。 国际癌症研究中心(iarc）将伏马毒素列为2b 类致癌物质(即人类可能致癌物），并对其在饲料及食品中含量做了限量(1～3 mg/kg)规定。
3.国内外已建立了多种伏马毒素的检测方法，已经应用的有高效液相色谱（hplc）、毛细管气相色谱法（gc）、毛细管电泳技术（ce）、液质联用（lc/ms）、气质联用（gc/ ms）及酶联免疫吸附检测（elisa）等方法。其中高效液相色谱法（hplc），灵敏度高，在全球范围内的玉米及其制品的调查中，90% 以上的实验室用的都是hplc 法，其检测限可以达到 0.05～0.1 mg/kg。但是，该法需要对检测样品进行严格的预处理，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，同时要求有专业的操作人员，不利于在基层推广使用及大量样本筛选。
4.免疫学技术具有敏感、特异、简便的特点，近年来已被应用于伏马毒素的残留检测。而胶体金法虽然具备操作简单、检测时间短和无需专业技术人员操作等优点，但其灵敏度相对不足，加大了样本干扰，同时定量也相对较差。因此开发高灵敏、可定量、操作更加简便的检测方法并推广应用，具有十分重要的意义。
[0005] 中国专利cn201210433003.5公开了 检测伏马毒素的elisa试剂盒的制备及检测方法，其包括酶标板、伏马毒素标准品、伏马毒素抗体工作液、伏马毒素酶标二抗工作液、底物液a、底物液b、终止液和浓缩洗涤液，该检测方法特异性和灵敏性不够高，操作过程比较繁琐。
[0006]
另外，伏马毒素人工抗原目前主要采用戊二醛法跟胺基偶联，但此法不可控，可能发生的副反应很多，可以形两个小分子间反应，两个载体蛋白间反应，可能会出现每次出来的结果不一样，所以此法重复性非常差。而本发明提供的合成方案，只有一种反应可能，那就是载体蛋白上面的羧基经活化后，只能单一的伏马毒素上的胺基反应生成稳定的酰胺键结构。


技术实现要素：

[0007]
针对上述问题，本发明的目的第一个目的是提供一种人工抗原操作简单，避免了有机溶液的使用，一步反应可实现，同时全抗原结构中完整地保留了小分子的结构，提高了抗原的免疫原性的伏马毒素人工抗原及其制备方法。
[0008]
本发明的第二个目的是含上述伏马毒素抗原为免疫原，采用杂交瘤技术进行制备
得到的单克隆抗体。
[0009]
本发明的第三个目的是提供将伏马毒素人工抗原的应用。主要是用于时间分辨荧光定量免疫层析技术，可快速、便捷地实现伏马毒素的检测的试纸条以及制备方法。为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：一种伏马毒素人工抗原，所述人工抗原的结构如式ⅰ所示：其中，protein为蛋白质载体，n代表伏马毒素与蛋白质载体的连接数量，可能为10-40之间的任一数字。
[0010]
进一步的，上述的伏马毒素人工抗原，所述蛋白质载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
[0011]
本发明提供的第二个技术方案是这样的：上述伏马毒素人工抗原的方法，依次包括下述步骤：1）将载体蛋白采用edc和nhs进行活化，制备载体蛋白活化酯溶液；2）将伏马毒素溶于磷酸缓冲溶液中，形成小分子溶液；3）再将步骤2）制备的小分子溶液加至载体蛋白活化酯溶液中，室温下搅拌16～24h；4）带反应结束后室温透析，去除未反应的小分子物质，即可得到所述的伏马毒素人工抗原；步骤3）所述的载体蛋白和伏马毒素质量比为30-150:30。
[0012]
其合成路线如下：
进一步的，上述的伏马毒素人工抗原的制备方法，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液；所述透析采用的透析液为磷酸缓冲溶液；所述透析采用的透析液为磷酸缓冲溶液，透析时间为3天，每天换3次透析液。
[0013]
本发明还有一个技术方案是这样的：一种伏马毒素单克隆抗体，以第一个技术方案所述的伏马毒素抗原为免疫原，采用杂交瘤技术进行制备得到的单克隆抗体。
[0014]
第一个技术方案所述的伏马毒素人工抗原在制备伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条中的应用。
[0015]
本发明还有一个技术方案，一种伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条，所述纸条中的反应膜包被有第一个技术方案所述的伏马毒素人工抗原和鼠igg。
[0016]
进一步的，上述的一种伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括pvc板，所述的pvc板中部叠置包被有上述制备的伏马毒素人工抗原和鼠igg的反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，所述的反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，质控区靠近吸水垫。
[0017]
上述的伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，依次包括下述步骤：1）制备包被有人工抗原和鼠igg的反应膜以nc膜为反应膜，将nc膜固定粘贴在pvc背衬的中间部位，将载体蛋白为牛血清白蛋白的伏马毒素人工抗原用包被缓冲液调节浓度至0.1~0.5mg/ml，并将鼠igg用包被缓冲液也调节浓度至0.5~1mg/ml，按照 0.8~1.2
µ
l/cm的膜液量，将抗原和鼠igg划线到反应膜对应的检测区和质控区，检测区和质控区之间间隔为5 mm，放置 40~45℃烘箱处理48小时以，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有0.5% peg20000、1%蔗糖、0.5% bsa、0.05%叠氮化钠的0.01 m pbs缓冲液；
2）制备样品垫将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品本处理液中，浸泡5 min后，取出在37℃干燥24 h以上，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用样品垫处理液为含有0.05% 吐温20、1% 蔗糖、0.5% bsa、0.05%叠氮化钠的0.05m pbs缓冲液；3）时间分辨荧光免疫层析试纸条的组装：在pvc板背衬中部叠置步骤1）制得的反应膜，两端分别叠置步骤2）制得的样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，质控区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得时间分辨荧光免疫层析试纸条。
[0018]
上述的伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条用于定量检测伏马毒素。
[0019]
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：1、本发明合成的人工抗原操作简单，避免了有机溶液的使用，一步反应可实现，同时全抗原结构中完整地保留了小分子的结构，提高了抗原的免疫原性；2、将伏马毒素人工抗原结合elisa检测技术，对伏马毒素的ic50值可达88ng/ml；3、将伏马毒素人工抗原用于时间分辨荧光定量免疫层析技术，可快速、便捷地实现伏马毒素的检测，本发明中制备的伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试剂卡对伏马毒素的检测灵敏度可达34.27 ng/ml，另外该试纸条精密度高，且可在室温下稳定保存一年以上，可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
附图说明
[0020]
图1为时间分辨荧光免疫层析试纸条的性能评价标准曲线图；图2是本发明提供的伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条检测原理示意图。
[0021]
图中符合代表的组件及其类似组件如下：pvc底板-1；样品垫-2、结合垫-3；反应膜-4；吸水纸垫-5；检测t线-t；质控c线-c。
具体实施方式
[0022]
具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
[0023]
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0024]
实施例1 载体蛋白为牛血清蛋白的伏马毒素人工抗原的合成方法如下：载体蛋白为牛血清蛋白的伏马毒素人工抗原的合成方法如下：（1）称取100 mg牛血清白蛋白（bsa），使其充分溶解在5 ml的超纯水中，加入35mg nhs，充分溶解后再分批加入60mg edc（每次加入10mg，每次间隔时间为10-15min），并在常温下搅拌2h，形成载体蛋白活化酯溶液，（2）取3 mg伏马毒素，使其充分溶解在0.5 ml浓度为0.05 mol/l的pbs溶液中，形成小分子溶液，在搅拌下加入0.5ml步骤（1）所述的载体蛋白活化溶液，并在室温下搅拌20h；
（3）步骤（2）制得的溶液用0.01mol/l的pbs室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；（4）分装，于4℃保存备用。
[0025]
实施例2载体蛋白为血蓝蛋白的伏马毒素人工抗原的合成方法如下：（1）称取50mg血蓝蛋白（klh），使其充分溶解在2.5ml的超纯水中，加入18mgnhs，充分溶解后再分批加入30mgedc（每次加入5mg，每次间隔时间为10-15min），并在rt下搅拌2h，形成载体蛋白活化溶液，（2）取3mg伏马毒素，使其充分溶解在0.5ml浓度为0.05mol/l的pbs溶液中，形成小分子溶液，在搅拌下加入0.5ml步骤（1）所述的载体蛋白活化溶液，并在室温下搅拌16~24h；（3）步骤（2）制得的溶液用0.01mol/l的pbs室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；（4）分装，于4℃保存备用。
[0026]
实施例3伏马毒素单克隆抗体的制备以实施例2制备的载体蛋白为血蓝蛋白的伏马毒素人工抗原为免疫原，与等体积弗氏佐剂乳化后，免疫balb/c小鼠。每只鼠免疫剂量为50~100
µ
g，免疫间隔2周，免疫3次后，采小鼠尾部静脉血检测血清效价。如抗体效价不达要求，需加强免疫，待抗体效价不再升高后，以100
µ
g全抗原进行皮下加强免疫，5天后取小鼠脾细胞与sp20细胞融合。融合后的细胞在hat培养基中筛选，5天后以完全培养基替换成hat培养基进行培养。用elisa对细胞上清进行检测，将检测结果为强阳性的孔内细胞进行有限稀释法克隆培养，经3次克隆培养检测后，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞放大培养后，接种至小鼠腹腔，产生含抗体的腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，即可得到高纯度、高特异性的单克隆抗体，用含0.05%叠氮钠，ph7.4的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体稀释至0.05
µ
g/ml，4℃保存。
[0027]
实施例4伏马毒素人工抗原在elisa中的应用与效果评价elisa检测中使用的伏马毒素人工抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白。
[0028]
用ph9.6的碳酸盐缓冲液作包被稀释液，将伏马毒素人工抗原稀释至0.1
µ
g/ml，按100
µ
l/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被过夜，甩干，按250
µ
l/孔加入1%bsa，磷酸盐缓冲液中37℃封闭1h，甩干，干燥后真空包装保存。
[0029]
向包被有伏马毒素人工抗原的微孔酶标板中加入伏马毒素系列标准溶液20
µ
l/孔，再加入浓度为0.05
µ
g/m的伏马毒素单克隆抗体溶液100
µ
l/孔，37℃反应0.5h；甩干后，加入洗液300
µ
l/孔，洗涤3次后拍干；再加入酶标二抗100
µ
l/孔，37℃反应0.5h；再次洗涤3次后拍干，分别加入50
µ
l/孔的显色液a和显色液b，37℃反应15min；加入2m硫酸50
µ
l/孔终止，设定酶标仪于450nm波长测定每孔的od值。结果如表1。
[0030]
表1
通过表1数据，采用elisa calc软件进行四参数logistic曲线拟合绘制标准曲线（如图1所示），伏马毒素的线性方程为：y =(a-d)/[1+(x/c)^b]+d，r2=0.997，a=2.40，b=0.89，c=73.46，d=0.20，x表示待测物浓度，y表示od值，通过计算得到ic50值为88 ng/ml，在50~4050 ng/ml呈线性关系。
[0031]
实施例5 时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备本技术提供的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法如下：1）制备包被有人工抗原和鼠igg的反应膜：以硝酸纤维素膜（nc膜）为反应膜，将nc膜固定粘贴在pvc背衬的中间部位，将载体蛋白为牛血清白蛋白的伏马毒素人工抗原用包被缓冲液调节浓度至0.1~0.5mg/ml，并将鼠igg用包被缓冲液也调节浓度至0.5~1mg/ml，按照 0.8~1.2
µ
l/cm的膜液量，将抗原和鼠igg喷到反应膜对应的检测区和质控区，检测区和质控区之间间隔为5 mm，放置 40~45℃烘箱处理48小时以，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有0.5% peg20000、1%蔗糖、0.5% bsa、0.05%叠氮化钠的0.01 m pbs缓冲液。
[0032]
2）制备样品垫将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品本处理液中，浸泡5 min后，取出在37℃干燥24 h以上，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用样品垫处理液为含有0.05% 吐温20、1% 蔗糖、0.5% bsa、0.05%叠氮化钠的0.05m pbs缓冲液。
[0033]
3)时间分辨荧光免疫层析试纸条的组装：在pvc板1背衬中部叠置步骤1)制得的反应膜3，两端分别叠置步骤2)制得的样品 垫2和吸水垫5，反应膜3和吸水垫5、样品垫2相搭连，检测区靠近样品垫，质控区靠近吸 水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得时间分辨荧光免 疫层析试纸条，如图2所示。
[0034]
为了证明本技术提供的技术方案的技术优点，下面给出本技术提供的时间分辨荧光免疫层析试纸条性能评价、稳定性研究和精密度测试实验。
[0035]
1、时间分辨荧光免疫层析试剂卡的性能评价（1）时间分辨荧光微球标记的伏马毒素单克隆抗体的制备：取1l时间分辨荧光微球溶液（荧光微球固含量1%，即含微球5 mg），并经超声波处理；搅拌下分别加入10 mg nhs和5 mg dec，控制微球溶液的温度为4~10℃，并在此温度下活化90 min；活化完后，反应液在10000 rpm下离心10 min，除去上清，该操作重复3次，最后一次离心，除上清后，加入1 ml 0.01m的pbs缓冲液重悬微球；加入0.3 mg伏马毒素单克隆抗体，充分混匀后，在室温下搅拌8 h以上；偶联完成后，反应液在10000 rpm下离心10 min，除去上清，加入1 ml荧光缓冲液，超声重悬后，离心、除去上清，该操作重复3次，最后一次离心，除上清后，加入1 ml荧光缓冲液超声重悬荧光微球，2~8℃冰箱保存备用，所用荧光缓冲液为含有0.5% peg20000、2%蔗糖、0.1%吐温20，0.5% bsa、0.05% 叠氮化钠的0.01 m pbs缓冲液。
[0036]
（2）时间分辨荧光微球标记的伏马毒素单克隆抗体检测液的制备：将上述荧光微球标记的伏马毒素单克隆抗体取出放置至室温，用荧光缓冲液稀释100~1000倍成荧光微球标记的伏马毒素单克隆抗体检测液，荧光缓冲液为含有0.5% peg20000、2% 蔗糖、0.1%吐温20，0.5% bsa、0.05% 叠氮化钠的0.01m pbs缓冲液，然后置于2~8℃冰箱保存备用。
[0037]
（3）用0.01 m磷酸盐缓冲液pbs配备一系列不同浓度的伏马毒素的标准溶液，然后
取上述制备的荧光微球标记的伏马毒素单克隆抗体检测液20
ꢀµ
l和100
ꢀµ
l配制好的系列标准品溶液混合1 min后，取80
ꢀµ
l滴加到时间分辨荧光免疫层析试剂卡上，15 min后，用荧光定量检测仪读取t/c的荧光信号值比值，检测试验设置3组重复。再通过系列标品浓度对应的t/c值建立四参数logistic曲线，曲线所得的四个参数值录入荧光定量检测仪的标定软件，即可实现时间分辨荧光免疫层析试剂卡在荧光免疫层析分析仪上的快速定量检测，测点结果如表2所示。
[0038]
表2通过对不同伏马毒素浓度的t/c值进行了测定，并计算了b/b0（不同浓度的标准品测试卡t/c值与含量为0 ng/ml的标准品测试卡t/c值的比值），结果如上表所示。从表中可看出，当伏马毒素的含量为78.0 ng/ml时，其b/b0值为0.64，说明此浓度下检测的t/c值与含0
ꢀµ
g/l浓度的伏马毒素的时间分辨荧光免疫层析试剂卡的t/c值有明显差异。含量为0的标准品，测试20次，t/c均值为6.48，t/c标准差(sd）为0.51，t/c均值-2sd = 5.46,代入表2的标准曲线，得到浓度为34.27ng/ml，故时间分辨荧光免疫层析试剂卡对伏马毒素的检测灵敏度可达34.27ng/ml。
[0039]
通过上表数据，采用elisa calc软件进行四参数logistic曲线拟合绘制标准曲线（如下图2所示），所得曲线的线性方程为：y=(a-d)/[1+(x/c)^b]+d，r2=0.9996，a=5.32，b=-2.53，c=126.64，d=0.043，线性方程中x表示待测物浓度，y表示t/c值。在荧光免疫层析分析仪的定量曲线设置界面当中，分别将a、b、c、d的值录入时间分辨荧光免疫层析分析仪的标定软件，即可实现时间分辨荧光免疫层析试剂卡的快速定量检测。
[0040]
2、时间分辨荧光免疫层析试剂卡的稳定性研究时间分辨荧光免疫层析试剂卡保存的条件为室温，为了确保试纸条的稳定性，对试纸条进行了加速破坏性实验，分别在室温、45℃条件下连续放置60天，并在第3天，第6天，第15天，第30天和第60天分别检测含量为156 ng/ml的标准品的荧光信号值，t值为检测区荧光信号值，c值为质控区荧光信号值，试验设置3组重复，结果参见表4和表5。
[0041]
表3
ꢀ
由上表可知，在常温和45℃下密封保存的时间分辨荧光免疫层析试剂卡60天后，t线、c线和t/c值均无明显变化，t值、c值、t/c值的变异系数（cv%）均小于6.5%，说明时间分辨荧光免疫层析试剂卡在加速实验45℃下最少可稳定保存60天。因此，时间分辨荧光免疫层析试剂卡可在室温下稳定保存一年以上，完全可以满足市场在保存和运输过程中的要求。
[0042]
3、时间分辨荧光免疫层析试剂卡的精密度测试以试纸条的检测区、质控区和t/c值的板内误差和板间误差来表示该方法的精密度，并分别以板内变异系数和板间变异系数来体现板内误差和板间误差；标准品选择检测156 ng/ml。板内变异系数的测定是对同一大板的10条时间分辨荧光免疫层析试剂卡的检测区和质控区信号值，以及t/c值的数据，并对这些数据进行离散程度分析。板间变异系数的测定是对不同大板的10条时间分辨荧光免疫层析试剂卡的检测区和质控区信号值，以及t/c值的数据，并对这些数据进行离散程度分析。按变异系数公式cv％=[标准偏差sd值/平均值]
×
100％即可分别计算出时间分辨荧光免疫层析试剂卡的板内变异系数和板间变异系数。
[0043]
表4
由上表可知，通过同板内的10张时间分辨荧光免疫层析试剂卡的测试，检测区和质控区位置的荧光信号数值以及t/c值的范围分别为282367~312510，97862~108138和2.63~3.16。通过变异系数计算公式得出这10张时间分辨荧光免疫层析试剂卡的t值，c值和t/c值的板内变异系数分别为4.21%，4.48%和4.99%，说明试纸条的板内变异系数小，精密度高，可满足试纸条的定量的要求。
[0044]
表5由上表可知，通过对不同板内的10张时间分辨荧光免疫层析试剂卡的测试，检测
区和质控区位置的荧光信号数值以及t/c值的范围分别为280503~311821，87875~98151和2.89~3.52。通过变异系数计算公式得出这10张试纸条的t值，c值和t/c值的板间变异系数分别为4.85%，4.96%和4.81%，说明试纸条的板间变异系数小，精密度高，可满足试纸条的定量的要求。