硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水的生物氨制剂使用方法与流程

1.本发明具体涉及一种硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水的生物氨制剂使用方法。


背景技术：

2.酸性矿山废水(acid mine drainage，amd)是全球采矿业面临的最严峻的环境挑战之一。amd是矿石开采过程中堆积的含硫废料(如废石、尾矿、低品位矿石等)，在雨水、自然络合剂、微生物的共同作用下被氧化分解的结果，其特征为酸性强(ph＝0.5-3.5)、重金属离子(如zn、cu、pb、cd等)和硫酸根浓度高等。即使在矿山关闭后的几十年甚至几个世纪，amd仍将保持活跃，对附近地下水或土壤造成严重污染，威胁周边环境安全和人类健康。据报道，我国amd年排放量超36亿吨，占全国工业废水总排放量的10％，而处理率却仅为4.3％。为应对amd污染等矿业突出问题，因此，解决amd污染问题，实现矿业绿色发展，是我国生态文明建设的迫切需求。
3.amd的生物法处理技术具有化学试剂消耗小、成本低、环境友好等优点，已受到国内外广泛关注。amd的生物处理主要基于硫酸盐还原菌的群落活性，在厌氧条件下，经atp磺酰化酶、aps还原酶和异种亚硫酸盐还原酶等一系列相关酶的作用，硫酸盐作为末端电子受体还原为硫化氢(h2s)并产生碱度，从而降低amd酸性并硫化沉淀重金属[5]。与化学氢氧化物沉淀相比，生物沉淀金属硫化物具有以下优势：金属硫化物溶解度极低，在较宽的ph值范围内沉淀物具有高稳定性，沉淀分离更具选择性；如果amd中存在配合、螯合态重金属，硫酸盐还原菌代谢能破坏其多齿配体结构，使沉淀更具有效性。然而，硫酸盐还原菌与amd极端环境兼容性差，难以保持个体和群落水平的表型功能，极大限制了其在amd处理中的应用。首先，硫酸盐还原菌多dsr-ab型异化还原细菌，如desulfovibrio、desulfobulbus、desulfobacter，主要生存于偏中性的环境中(污泥、湖泊沉积物等)，仅在ph值为5-8时表现活性。尽管在不同amd生境中已分离出耐酸性的菌株，如thermocladium，caldirvirga 等，但在ph＜5.5时其功能仍被抑制。在amd极酸条件下，硫酸盐还原菌胞外高浓度的h+增加细胞压力使细胞代谢紊乱，so42-的细胞膜转运机制受阻；胞内nadh或铁氧还原蛋白受破坏，进而阻断so42-的介质活化途径，甚至导致细胞裂解。此外，amd中缺乏微生物生长发育所需的营养物质，如有机碳，其不仅为生物代谢和细胞组装提供能量和原材料，还与微生物群落的协同互作密切相关(如生物膜形成、细胞运动、信号传导等)。然而，多数amd中可利用有机碳十分匮乏，总含量低于10ppm，导致硫酸盐还原菌群整体代谢负荷高、功能衰退快。因此，要保证生物硫酸盐还原amd处理系统的稳定运行，必须解决：(1)降低amd酸性(ph至5以上)以解除其对硫酸盐还原菌的逆境胁迫；(2)增加外源营养物质，尤其是有机碳，以支撑硫酸盐还原菌的代谢增殖。
[0004]
目前，分析已有研究发现，在amd硫酸盐还原处理的前端结合中和法作为预处理工艺，是提升其ph值、降低毒性最直接有效的方法：添加中和试剂一定程度上对amd进行了稀释；另一方面，部分金属(如铁、铝)在ph提升的过程中沉淀析出，并吸附其他有毒金属或与其发生共沉淀，降低amd毒性。如果仅将ph定向提升至5，不仅避免产生碱性废水，且无两性
金属反溶问题。然而在工程实例中，采用传统的钙基中和剂(cao、ca(oh)2)会有大量caso4析出，既增加污泥处置难度，更影响后续硫酸盐还原菌代谢功能；采用其他中和剂(na2co3、naoh、nh4oh)可有效减轻污泥处置压力，中和效率更高，但其成本是钙基中和剂的3-15倍，不具备可持续性。
[0005]
同样的，生物法硫酸盐还原的外加碳源也面临着成本和效率的双重考验。 amd生物处理采用的碳源主要有结构复杂的有机废物(如秸秆、锯末、蘑菇废料等)和结构简单的商用碳源(如甲醇、乙醇、乙酸等)两类。有机废料价格低、易获得，但其主要为糖苷键和肽键连接的大分子难水解有机物(纤维素、木质素等)，需要先通过复杂的水解酸化菌发酵成醇和有机酸，然后才能被硫酸盐还原菌利用。由于多级生物降解过程，有机废料完全矿化的时间显著增加，金属去除率达到80％时的处理周期可达30天以上。商用碳源可有效缩短amd 生物硫酸盐还原的处理周期至7天以内，且金属去除率搞达95％以上。这些小分子碳源结构简单，能直接进入calvin循环，经二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶作用被硫酸盐还快速利用，但成本高昂，每立方米废水的碳源成本为100-500usd。从工程化应用的角度出发，如何在保障amd处理高效率的同时降低经济成本是生物硫酸盐还原法的关键。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水的生物氨制剂使用方法，该硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水的生物氨制剂使用方法可以很好地解决上述问题。
[0007]
为达到上述要求，本发明采取的技术方案是：提供一种硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水的生物氨制剂使用方法，该硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水的生物氨制剂使用方法包括如下步骤：
[0008]
从尿液、粪便中筛选了9种具有产氨功能的尿素降解菌，并以尿素为主要培养基质产生物氨，用于生物硫酸盐还原前的中和处理；
[0009]
混合培养24小时后的含氨基质ph达9-9.5，氨含量高达10g/l，以提升ph，相比无机碱对amd的中和效率更高；
[0010]
在以尿素为唯一氮源的限制性代谢胁迫条件下，产氨菌的隐秘基因簇编码信息被唤醒，细胞迅速增殖的同时还产生次级代谢产物；
[0011]
生物氨基质中有机质总量高6000mg/l，其遗传信息中对应于uref基因的 mrna paralog框外aug密码子启动起始密码子，合成拟南芥脲酶和三种辅酶，进而激活脲基乙醇酸裂解产生长链烷基/脂酰－coa次级代谢产物；
[0012]
鸟氨酸－尿素循环补碳固定途径被激活，tms非迭代结构域通过碳链延长和可变修饰装配生产循环代谢物，实现胞内碳氮周转和重新分配，进而增加生物量积累；
[0013]
生物氨基质中的有机组分在进入amd后被酸解，影响降酸过程并释放促生因子，强化硫酸盐还原菌生长代谢活性；
[0014]
强酸能够通过支链断裂、缩聚、基团转移转等方式解聚有机质，而生物氨基质中的中长链次级代谢产物很被amd酸解转化为小分子物质；
[0015]
细胞壁主要为肽聚糖和脂多糖，结构相对简单而易被破坏，在amd极酸生态位中，细胞质发生质子梯度崩溃，细胞中的脂类、多糖以及蛋白质生化异质释放脂肪酸、寡糖、多
肽；
[0016]
羧酸活化产生烯酰肉碱，经脱氢水合和硫醇化直接参与微生物的能量代谢；
[0017]
不饱和烃能通过加富马酸盐、羧化和厌氧羟基化等机制被激活，作为微生物代谢的电子供体；
[0018]
多肽亦可通过改变酶活和调节细胞外排泵等方式，在微生物的能量传输和环境抗逆中发挥重要作用。
[0019]
该硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水的生物氨制剂使用方法具有的优点如下：
[0020]
amd酸性强、毒性高、营养物少，导致硫酸盐还原菌存在功能活性差、代谢负荷高等问题，硫酸盐生物还原无法高效运行。传统的工业方案需要消耗大量化学试剂(中和剂、商用碳源)，不符合我国矿业生产可持续发展的背景，而采用有机废料作为碳源又存在周期长、效果差等缺点。本发明对生物氨重新定义，不仅应包含氨降低amd酸性，还含有大量生物质、次级代谢产物，作为碳源可以进一步利用，将amd生物处理法与尿素废水资源化有机结合，绿色、高效解决amd极端环境制约硫酸盐还原菌处理效能的技术问题。生物氨制剂在高效率、低成本刺激硫酸盐还原菌代谢方面优势突出。
附图说明
[0021]
此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部分，在这些附图中使用相同的参考标号来表示相同或相似的部分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
[0022]
图1示意性地示出了根据本技术一个实施例的产氨菌株菌落。
[0023]
图2示意性地示出了根据本技术一个实施例的菌株pca分析。
[0024]
图3示意性地示出了根据本技术一个实施例的脲酶pcr产物。
[0025]
图4示意性地示出了根据本技术一个实施例的生物硫酸盐还原数据图。
具体实施方式
[0026]
为使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图及具体实施例，对本技术作进一步地详细说明。
[0027]
在以下描述中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”、“示例”等等的引用表明如此描述的实施例或示例可以包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度，但并非每个实施例或示例都必然包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度。另外，重复使用短语“根据本技术的一个实施例”虽然有可能是指代相同实施例，但并非必然指代相同的实施例。
[0028]
为简单起见，以下描述中省略了本领域技术人员公知的某些技术特征。
[0029]
根据本技术的一个实施例，提供一种硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水的生物氨制剂使用方法，包括
[0030]
根据本技术的一个实施例，提出使用一种基于产氨菌尿素代谢的生物氨基质，多层级稳定并强化硫酸盐还原菌对amd的处理效能。生物氨基质是产氨菌经ure基因簇编码的脲酶复合体生物降解尿素而成的产物。使用生物氨基质作为中和剂不仅可有效降低amd酸性，还能实现含高浓度尿素(9.3-23g/l) 废水的资源化利用。此外，在以尿素为唯一氮源的限制性代谢胁迫条件下，产氨菌的隐秘基因簇编码信息被唤醒，细胞迅速增殖的同时还产
生多种次级代谢产物，而这些有机组分在进入amd后可能被酸解，影响降酸过程并释放促生因子，强化硫酸盐还原菌生长代谢活性。生物氨基质不仅能高效率、低成本降低amd酸性，还可释放硫酸盐还原菌潜在促生因子，强化amd生物处理效能的同时，实现降酸和脱硫操作单元一体化。
[0031]
根据本技术的一个实施例，该发明的原理如下：
[0032]
从尿液、粪便等环境中筛选了9种具有产氨功能的尿素降解菌，并以尿素为主要培养基质产生物氨，用于生物硫酸盐还原前的中和处理。混合培养24小时后的含氨基质ph达9-9.5，氨含量高达10g/l，能有效提升ph，相比无机碱对amd的中和效率更高。此外，在以尿素为唯一氮源的限制性代谢胁迫条件下，产氨菌的隐秘基因簇编码信息被唤醒，细胞迅速增殖的同时还产生多种次级代谢产物，生物氨基质中有机质总量高6000mg/l：其遗传信息中对应于uref基因的mrna paralog框外aug密码子启动起始密码子，合成拟南芥脲酶和三种辅酶，进而激活脲基乙醇酸裂解产生长链烷基/脂酰－coa等次级代谢产物；鸟氨酸－尿素循环(ouc)补碳固定途径被激活，tms非迭代结构域通过碳链延长和可变修饰装配生产循环代谢物，如醇类(癸醇、十二烷醇等)、有机酸(肉豆蔻酸、脱氢枞酸等)、烃类(十八烃、二十烃等)，实现胞内碳氮周转和重新分配，进而增加生物量积累。生物氨基质中的有机组分在进入amd后被酸解，影响降酸过程并释放促生因子，强化硫酸盐还原菌生长代谢活性。强酸能够通过支链断裂、缩聚、基团转移转等方式解聚有机质，而生物氨基质中的中长链次级代谢产物很被amd酸解转化为小分子物质(短链醇、羧酸、不饱和烃等)；另一方面，细胞壁主要为肽聚糖和脂多糖，结构相对简单而易被破坏，在amd 极酸生态位中，细胞质发生质子梯度崩溃，细胞中的脂类、多糖以及蛋白质生化异质释放脂肪酸、寡糖、多肽等。这些潜在酸解产物可能作为促生因子通过不同作用机制强化微生物的功能活性。例如，短链醇能通过ω－氧化途径或醇－蛋白质双层介导作用影响细胞膜的特性，增加微生物的抗逆性能；羧酸活化产生烯酰肉碱，经脱氢水合和硫醇化直接参与微生物的能量代谢；不饱和烃能通过加富马酸盐、羧化和厌氧羟基化等机制被激活，作为微生物代谢的电子供体；多肽亦可通过改变酶活和调节细胞外排泵等方式，在微生物的能量传输和环境抗逆中发挥重要作用。
[0033]
根据本技术的一个实施例，该发明的具体描述如下：
[0034]
(1)产氨菌的筛选
[0035]
取土壤样品为产氨菌筛选样品源，在产氨菌筛选培养基(培养基1)上进行连续传代培养筛选。第一次传代时，将10g样品添加到装有200ml培养基1 的500ml锥形瓶中。将烧瓶在室温(120rpm)下振摇三天。之后，收集并离心100ml细胞悬液。然后将细胞沉淀重新悬浮在200ml的新鲜培养基1中，倒入新的锥形瓶中用于下一次传代。传代过程重复10次，然后将最后传代的 100ml培养物收集并离心后取细胞沉淀，作为产氨菌分离接种源。
[0036]
(2)产氨菌的分离
[0037]
于富含高浓度尿素的选择性培养基(培养基2)中筛选培养：营养肉汤(13g /l)；胰蛋白酶大豆肉汤(30g/l)；乳糖蛋白胨肉汤(35ml/l)；、脑心浸液肉汤(37g/l)、醋酸钠(8.2g/l)、硫酸铵(10g/l)和尿素(20g/l)。将所有肉汤培养基的初始ph调节至8.0。在高压灭菌后加入灭菌的尿素(通过0
·
45μm过滤灭菌)以防止高压灭菌条件下的化学分解。按照接种源：培养基2(固液比)为 1：10进行接种，然后将接种后的培养基2在30℃，130rpm/min摇床上有氧培养120小时。随后，将10倍稀释液(10-1
–
10-7)的等分试样分别接种于(200 μ
l)加有2％尿素(w/v)的非选择性营养琼脂(28g/l)固体培养基中(培养基 3)，在有氧条件下于32℃培养42小时。挑选琼脂板上生长的不同形态型的纯细菌菌落，获得分离后的产氨菌落。
[0038]
(2)产氨菌的纯化
[0039]
采用尿素琼脂培养基作为筛选产氨菌的纯化培养基(培养基4)：尿素20g/l、 nacl 5g/l、kh2po4 2g/l、蛋白胨1g/l、葡萄糖1g/l、酚红0.012g/l。将挑选的菌落接种在培养基中，然后在37℃下培养120小时。选择能够在培养期间将培养基从淡黄色变为粉红色的菌株，则为产氨菌。最终得到如下9种产氨菌：灰杆菌、普罗维登西亚菌、芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、短杆菌、枯草芽孢杆菌、人苍白杆菌、变形杆菌、假单胞菌。
[0040]
(3)生物氨制剂的制备
[0041]
选择以上九种尿素降解菌菌株进行单独培养后混合培养物获得生物氨制剂。单菌株在溶原肉汤中单独培养24小时。然后，将9种细菌培养物分别在由以下化合物组成的含尿素生长培养基中培养：蛋白胨(1g/l)、nacl(5g/l)、kh2po4 (2g/l)和尿素(20g/l))。含尿素生长培养基的制作方法：在添加尿素之前，用1m naoh将培养基的ph值调节至6.80
–
6.85，并在循环高压灭菌锅中灭菌11分钟。尿素溶液通过孔径为0.22μm的注射器过滤器过滤。接种比例为每种菌株培养物的1％(1ml培养物每100ml含尿素生长培养基)，培养48小时后将9种微生物的培养物按1：1比例混合获得生物氨制剂(混合后氨含量约 1g/l)。
[0042]
(4)amd的生物氨制剂预处理
[0043]
将生物氨制剂用于amd预处理，降低其酸性并增加有机质含量。取模拟 amd(加入znso4、cuso4、mnso4、稀硫酸调制)100ml，分批次加入上述生物氨制剂，每批次大约30秒内加入，同时搅拌均匀。每一批次完成后，测定amd的ph值，待ph计读书稳定后开始下一批次。当amd的ph到达5 以后，停止生物氨制剂投加。平均而言，每100ml的amd将消耗约105ml 生物氨制剂。同等浓度的合成氨(1g/l)被用于预处理，作为对照组。
[0044]
(5)硫酸盐还原菌处理amd
[0045]
将预处理后的amd离心以去除在ph升高过程中产生的金属硫酸氢盐，同时收集上清液，获得含有显着降低浓度的硫酸盐和金属的预处理流出物，用于进一步的生物硫酸盐还原。污水处理厂活性污泥被用作硫酸盐还原菌源。将80 ml预处理流出物(离心后)装入100ml厌氧瓶中。然后，通入氮气以去除任何溶解的氧，直到获得缺氧条件。氧气耗尽后，立即将瓶子移至厌氧工作站。将瓶盖紧压在瓶口上，使培养物与空气隔绝，然后移至恒温培养箱中，保持37℃的恒温14天。在培养开始和培养7天和14天后，收集5ml样品用于评估 srb细胞计数和测定硫酸盐浓度。srb的细胞计数通过mpn)稀释测定法估计的。通过使用硫酸盐试剂盒测量上清液中的硫酸盐浓度；使用aas 原子吸收光谱仪测定液相金属浓度。
[0046]
根据本技术的一个实施例，从尿液、粪便等环境中筛选了10株具有产氨功能的尿素降解产氨菌(图1)，经鉴定这些产氨菌属于灰杆菌、普罗维登西亚菌、芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、短杆菌、枯草芽孢杆菌、人苍白杆菌、变形杆菌、假单胞菌9种菌属。在尿素废水中开展生理生化实验，结果表明10株产氨菌48小时生物量累积在0.22-0.93od600、107-109cfu/ml之间，产生的生物氨基质ph可达9-9.5。使用urec引物进行pcr-dgge分析，结果显示不同分离株的条带位置和数量不同(图2)，基于条带位置的聚类分析表明，存在2个大组以及1个
癸醇(c12)、2-乙基-1-十二烷醇(c14)、正二十二烷醇-1(c24)、1-十六烷醇(c26)和1-二十烷醇(c32)以及不饱和醇——环十一烷甲醇(c12)。从c8到c23检测到7种有机酸，分子量范围为166.1到300.4g/mol。分析中有机酸的第一个明显峰是巯基乙酸，它是一种短链乙酸(c2)，而其他的都是具有单个c双键o的单长链有机酸，除了1,2-苯二羧酸，它有两个与芳环相连的邻位羧基。从c11-c35中发现了分子量从140.3到490.9g/mol的多种不饱和烃，而单链无环烯烃是主要种类。除了培养物中残留的尿素外，还检测到三种含氮化合物：甲酰胺、双吡咯并吡嗪二酮、2-甲基-6-(5-甲基-2-噻唑啉-2-基氨基)吡啶。此外，还检测到两种含硫有机化合物：1-十八烷基磺酰氯和亚硫酸-十八烷-2-丙酯。
[0051]
根据本技术的一个实施例，如图4所示，在生物氨制剂和合成氨分别预处理后的模拟amd中接种硫酸盐还原菌，结果表明:在硫酸盐还原菌厌氧培养的14 天内，用生物氨制剂和合成预处理的amd分别实现了92.3％和45.1％的硫酸盐还原率。就合成氨预处理的amd而言，硫酸盐浓度在前7天后显着下降(从1535.7 降至987.5mg/l)。从第7天到第14天，仅减少了144.7mg/l硫酸盐。合成氨预处理amd中硫酸盐还原菌生长的细胞数变化呈现出相似的趋势，即前7天细胞数从105下降到103，然后在14天后保持在该水平。使用生物氨制剂预处理的废水在整个期间硫酸盐浓度显着下降。7天后，硫酸盐浓度从1583.2下降到612.8mg/l，然后持续显着下降至122.3mg/l。前7天硫酸盐还原菌细胞数无显著变化。然后在14天后显着提高到～107个细胞/ml。显然，在进一步生物硫酸盐还原方面，生物氨制剂作为amd处理剂的性能优于合成氨。
[0052]
表2处理前后金属浓度对比
[0053][0054]
使用生物氨制剂处理后进行硫酸盐还原，amd金属浓度显著降低。zn、mn、cu的去除率分别为：》98％、93％、99％，而amd最终趋于中性(ph＝6.97)。相比之下，使用合成氨处理后进行硫酸盐还原，除zn以外，mn、cu的浓度变化不大。 mn、cu的去除率均为10％左右。上述结果说明，生物氨制剂能有效促进硫酸盐还原菌对金属的生物沉淀。
[0055]
以上所述实施例仅表示本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明保护范围。因此本发明的保护范围应该以所述权利要求为准。