一种芽孢杆菌菌株及其应用

1.本发明属于微生物分离培养技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌菌株及其应用。


背景技术：

2.甘蔗是我国南方重要的糖料作物，其产糖量占全国糖量的90％左右。而甘蔗是禾本科宿根作物，在同一地块的连年种植会导致一些病原菌在植株体内或土壤中逐年积累，使得病害严重，种性退化，对甘蔗产量和产糖量构成严重威胁。甘蔗根腐病是甘蔗生产中较为严重的一种土传病害，其会导致感病植株的根系呈褐色或腐烂、长势弱、活力差，造成大面积减。能够导致甘蔗根腐病发生的主要病菌有强雄腐霉(pythium arrhenomane)、pachymetra chaunorhiza、乌灵参(xylariasp).、芝麻茎点枯病菌(macrophomina phaseolina)、fusariummoniliforme.and pythium gramenicolasp.、共享镰刀菌(fusarium commune)、xylaria arbuscula。
3.目前为止，甘蔗根腐病在实际生产应用上手段较少。很多情况下使用化学药剂，其防效虽好，但同时带来了食品安全、生态环境等问题，并且出现土壤微生态失衡、盐渍化和酸化等一系列严重问题。而物理防治见效慢、成本高，不适应于大规模种植。因此，现有防治手段越来越难以满足甘蔗产业健康发展的需求，寻找有效控制甘蔗根腐病发生的方式变得十分重要。
4.生物防治对人畜安全、环境友好且不易引发抗药性，近年来，已有诸多关于拮抗菌防治植物根腐病的报道，例如，廖海浪等通过离体根的抑病试验表明健康黄连根系存在大量拮抗菌能有效防治黄连根腐病；许世洋等通过测量根围土壤中养分含量和土壤酶的活性表明6种菌剂复配能有效防治辣椒根腐病；张漫漫等发现从黄瓜根际土中分离得到的棘孢木霉fj035(trichoderma asperellum)能有效防治黄瓜根腐病。但是，在甘蔗根腐病拮抗菌的筛选及其生物防治的研究甚少。


技术实现要素：

5.本发明旨在解决上述技术问题，提供一种芽孢杆菌菌株，该菌株能够拮抗甘蔗根腐病，实现对甘蔗根腐病的有效防治。
6.本发明的技术方案为：
7.一种芽孢杆菌菌株，所述芽孢杆菌菌株命名为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01，所述菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：gdmccno：62694。
8.优选地，本发明所述芽孢杆菌菌株来源于患根腐病的甘蔗根际土。
9.本发明还提供所述芽孢杆菌菌株在生物防治甘蔗根腐病中的应用，通过应用试验，可知本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01能够拮抗甘蔗根腐病，实现对甘蔗根腐病的有效防治。
10.优选地，本发明所述芽孢杆菌菌株在生物防治甘蔗根腐病的具体步骤为：
11.(1)制备无菌发酵液：打制5个芽孢杆菌菌饼后接种至nb培养基中，在37℃、180r/min条件下培养24h，在8000r/min转速下离心20min，上清液经过滤器过滤，获得无菌发酵液；
12.(2)制备分生孢子悬浮液：在100ml的pdb培养基中接种3个5mm的甘蔗根腐病病原菌菌饼，在28℃、130r/min条件下振荡培养5d，获得分生孢子悬浮液；
13.(3)将无菌发酵滤液分别与分生孢子悬浮液和pda培养基混合均匀，在28℃下培养3d，观察抑菌效果。
14.本发明上述步骤(3)中，无菌发酵滤液与分生孢子悬浮液混合时：分别按照体积比为1:9、2:8、3:7混合均匀；无菌发酵滤液与pda培养基混合时：分别按照体积比为1:9、2:8、3:7混合均匀。
15.本发明上述pda培养基原料为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15g、蒸馏水1000ml；pdb培养基原料为：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml。
16.作为另一种优选方案，本发明所述芽孢杆菌菌株的应用，具体步骤为：
17.(1)芽孢杆菌菌悬液：挑取芽孢杆菌菌落接种于100mlnb培养基中，置于恒温摇床，在28℃，180r/min，振荡培养24h后得到芽孢杆菌菌悬液；
18.(2)向无菌土中以重量比为11:1加入蛭石，加入无菌土同重量的无菌水搅拌均匀后装入pvc管，加入无菌土重量的3.6-4.0％芽孢杆菌菌悬液，将消毒处理过的黑皮果蔗块茎植入，培养7d后接入甘蔗根腐病病原菌，接种45d后，观察效果。
19.优选地，本发明所述甘蔗根腐病病原菌为共享镰刀菌(fusarium commune)。本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01对共享镰刀菌(fusarium commune)引起的甘蔗根腐病具有显著的防治效果。
20.优选地，本发明所述步骤(1)中，nb培养基原料为：蛋白胨10g，牛肉粉3g，nacl5g、蒸馏水1000ml。
21.优选地，本发明芽孢杆菌菌悬液的od
600
为0.5，该浓度下的芽孢杆菌菌悬液对于甘蔗根腐病具有最好的防治效果。
22.由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：
23.1、本发明筛选得到芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01，对共享镰刀菌具有较好的抑菌活性。
24.2、本发明的芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01能够拮抗甘蔗根腐病，实现对甘蔗根腐病的有效防治。
25.菌种保藏说明：本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株(bacillus velezensis)gnzy01，于2022年8月11日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址：广州市先烈中路100号，广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为gdmccno：62694。
附图说明
26.图1为本发明实施例1中贝莱斯芽孢杆菌gnzy01对共享镰刀菌的对峙效果图。
27.图2为本发明实施例1中贝莱斯芽孢杆菌gnzy01的形态学特征图。
28.图3为本发明实施例1中贝莱斯芽孢杆菌gnzy01的系统发育树。
29.图4为本发明实施例2中贝莱斯芽孢杆菌gnzy01发酵液对共享镰孢菌的菌丝生长
抑制效果图。
30.图5为本发明实施例2中贝莱斯芽孢杆菌gnzy01发酵液对共享镰刀菌的孢子萌发抑制效果图。
31.图6为本发明实施例3中贝莱斯芽孢杆菌gnzy01对甘蔗生长地上部的影响图。
32.图7为本发明实施例3中贝莱斯芽孢杆菌gnzy01对甘蔗生长地下部根系生长的影响图。
33.图4和图5中的标号：ck-1为10％体积浓度、ck-1为20％体积浓度、ck-3为30％体积浓度。
具体实施方式
34.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.以下实施例中：
36.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，pda)组成：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15g、蒸馏水1000ml；
37.马铃薯葡萄糖水培养基(potato dextrose broth，pdb)组成：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml；
38.牛肉膏蛋白胨培养基(nutrient agar，na)组成：蛋白胨10g，牛肉粉3g，nacl5g，琼脂15g、蒸馏水1000ml；
39.牛肉膏蛋白胨培养液(nutrient broth，nb)组成：蛋白胨10g，牛肉粉3g，nacl5g、蒸馏水1000ml。
40.共享镰刀菌(fusarium commune)由广西大学农学院甘蔗生物学重点实验室分离保存。
41.实施例1：贝莱斯芽孢杆菌gnzy01的获得与鉴定
42.(1)根际土壤样品采集：在广州市南沙区大岗镇南顺一村等地区，根据患根腐病的甘蔗严重程度划分为四个典型田块，每个田块采用五点取样法随机选取五株甘蔗采集根际土壤样品，带回实验室置于-20℃冰箱保存；
43.(2)土壤菌悬液的制备：取保存根际土壤样品10g置于250ml三角瓶中，加入90ml无菌水以及少量玻璃珠，在28℃、200r/min下振荡培养20min，于稳定环境中室温放置20min，得到土壤菌悬液；
44.(3)贝莱斯芽孢杆菌gnzy01分离与纯化：使用平板稀释梯度法分离贝莱斯芽孢杆菌，吸取1ml土壤菌悬液加入装有9ml无菌水的试管中，另取试管稀释得到10-1
、10-2
、10-3
和10-4
4个浓度梯度的土壤菌悬液，每梯度吸取20μl菌悬液，均匀涂布于na平板上，进行五次重复，28℃培养3d后，观察菌落的形成，挑取形态、颜色等培养性状不同的单菌落进行纯化和保存；
45.(4)菌株初筛：采用平板对峙法进行贝莱斯芽孢杆菌初筛，选取已活化、培养3d的共享镰孢菌菌落，用直径5mm的无菌打孔器打制菌饼置于pda平板中央，在距共享镰刀菌
20mm处呈三角形对称的3个点接入步骤(3)挑取出来的单菌落，于28℃恒温培养3d后观察抑菌圈的形成，挑选具有抑菌圈的7株菌株进行复筛；
46.(5)菌株复筛：采用与步骤(4)初筛相同的方法打制共享镰刀菌菌饼置于pda平板中央，在相同点位接入步骤(4)初筛得到的7株菌株，进行五次重复，以不接种抑菌菌株的pda平板作为对照，于28℃恒温培养3d后测量共享镰刀菌的菌落直径(mm)，计算抑菌率如下：
[0047][0048]
。(结果如表1)
[0049]
通过复筛，得到抑菌率最高的拮抗菌株gnzy01，其对共享镰刀菌的对峙效果，如图1。
[0050]
表1 7株菌株对共享镰刀菌的抑制效果
[0051]
菌种编号抑菌率/％抑菌圈直径/mmgnzy0172.83a18.87
±
0.87bgnzy0259.98b18.96
±
0.86bgnzy0318.49g12.07
±
0.29dgnzy0424.04f15.58
±
0.49cgnzy0554.75c18.66
±
0.82bgnzy0631.39e24.98
±
2.16agnzy0746.83d19.56
±
0.68bck
‑‑
41.85
±
0.18(菌落直径)
[0052]
注：同列数据后不同小写字母表示在p《0.05水平差异显著(duncan氏新复极差法)。下同。
[0053]
对上述的菌株gnzy01通过形态特征、生理生化实验和16srdna序列分析对该菌株进行鉴定，结果如下：
[0054]
(1)形态学特征：参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》进行：将菌株gnzy01接种到pda培养基上，28℃下培养24h后生长情况良好。经革兰氏染色呈阳性，菌体细胞呈短杆状，菌落形态呈规则圆形，边缘整齐，淡黄色无光泽，不透明，如图2所示。
[0055]
(2)生理生化特征：参照《柏杰明细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行：菌株gnzy01可以利用供试10种碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、甘露糖、肌醇、山梨醇、甘露醇)，能在3％、5％、7％、10％的nacl溶液中生长。在h2s产生试验中呈阳性、菌株在淀粉水解试验中呈阳性、v-p测定试验中呈阳性、水解纤维素试验中呈阳性、吲哚试验中呈阳性、硝酸盐试验中呈阳性、甲基红染色试验中呈阴性、接触酶试验中呈阳性、牛奶分解试验中呈阴性、柠檬酸盐试验中呈阴性、运动性试验中呈阳性，如表2所示。
[0056]
表2芽孢杆菌菌株gnzy01的生理生化特性
[0057][0058]
注：“+”和“－”分别表示阳性和阴性。
[0059]
(3)16srdna基因扩增和序列分析:
[0060]
利用细菌16srdna通用引物以primer27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'和primer1492r:5'-tacggytaccttgttacgactt-3'对菌株gnzy01的dna进行pcr扩增。pcr反应体系总体积为25μl：dna模板1μl，引物27f/1492r各1μl，2
×
taq pcr master mix12.5μl，ddh2o 9.5μl。pcr反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火35s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测,并将其送往生工生物工程(上海)有限公司测序,测序结束在ncbi进行blast比对后，用megax软件进行序列分析，构建系统发育树(见图3)。
[0061]
上述测序结果显示菌株gnzy01的序列长度为1407bp，测序结果在ncbi中进行blast同源性比对。菌株gnzy01用16srdna序列在ncbi上进行blast比对，发现菌株gnzy01与芽孢杆菌(bacillus velezensis mt649755.1)的相似度最高，相似度达82％，要90％以上的相似度通过下载15个芽孢杆菌属不同种的菌株序列，并选择粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)作为外群菌株，通过megax构建系统发育进化树。发现菌株gnzy01与芽孢杆菌(bacillus velezensis srcm101368)处于同一支上。
[0062]
综上，鉴定菌株gnzy01菌株为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，其命名为贝莱斯芽孢杆菌gnzy01。
[0063]
(4)芽孢杆菌gnzy01的保藏
[0064]
通过上述鉴定结果，将贝莱斯芽孢杆菌gnzy01，于2022年8月11日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址：广州市先烈中路100号，广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为gdmccno：62694。
[0065]
实施例2：芽孢杆菌菌株(bacillus velezensis)gnzy01发酵液抑制共享镰刀菌的试验
[0066]
(1)制备芽孢杆菌发酵液：用无菌打孔器(φ＝5mm)打制5个芽孢杆菌菌饼后接种至nb培养基中，在37℃、180r/min条件下培养24h，在高速冷冻离心机以8000r/min转速下离心20min，上清液经过滤器过滤，获得芽孢杆菌发酵液；
[0067]
(2)制备分生孢子悬浮液：在100ml的pdb培养基中接种3个5mm的甘蔗根腐病病原菌菌饼，在28℃、130r/min条件下振荡培养5d，获得分生孢子悬浮液；
velezensis)gnzy01菌株发酵液对共享镰刀菌的菌丝生长和孢子萌发的抑制率随发酵液浓度的增加而增强。
[0078]
实施例3：芽孢杆菌菌株(bacillus velezensis)gnzy01生防效果试验
[0079]
(1)芽孢杆菌菌悬液：挑取芽孢杆菌gnzy01菌落接种于100mlnb培养基中，置于恒温摇床，在28℃，180r/min，振荡培养24h后得到芽孢杆菌菌悬液；
[0080]
(2)向无菌土中以重量比为11:1加入蛭石，加入无菌土同重量的无菌水搅拌均匀后装入pvc管，加入无菌土重量的3.8％芽孢杆菌菌悬液(od
600
＝0.5)，用1％naclo溶液消毒处理过的黑皮果蔗块茎植入，培养7d后接入共享镰孢菌，接种45d(45d内按常规管理方法管理)后取出甘蔗根系扫描并分析结果，芽孢杆菌菌株(bacillus velezensis)gnzy01对甘蔗地上部的影响见图6，对甘蔗地下部根系生长影响见图7。
[0081]
图6和图7提及的对照组(ck)具体为：向无菌土中以重量比为11:1加入蛭石，加入无菌土同重量的无菌水搅拌均匀后装入pvc管，加入无菌土重量的3.8％无菌水，用1％naclo溶液消毒处理过的黑皮果蔗块茎植入，培养7d后接入共享镰孢菌，接种45d(管理方法和条件同上)后取出甘蔗根系扫描并分析结果。(即不添加芽孢杆菌菌悬液)
[0082]
从图6结果可见，芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01对患病甘蔗地上部生长影响明显。45d后，处理组的长势显著优于对照组，其中对甘蔗株高和叶面积影响最为明显。
[0083]
从图7的结果可见，芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01对患病甘蔗地下部根系生长作用明显。从总根长来看，芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01抑制共享镰刀菌促进甘蔗根长作用非常显著，芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01处理后的甘蔗根长(778.16dm)显著长于对照组的患病植株(36.75dm)。从总根表面积来看，生防菌处理后总根表面积增加了306.61dm2；从总根体积上看，处理组的总根体积较对照组增加了7.28dm3。综合认为用芽孢杆菌(bacillus velezensis)gnzy01处理患病植株后，能增长根的长度和增加植株的表面积与体积，增强了植株的抵抗能力和抗病能力，对植株的生长发育有着促进作用。
[0084]
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。