辣椒红色素合成相关转录因子及其应用

1.本发明属于遗传领域，具体涉及辣椒红色素合成相关转录因子及其应用。


背景技术：

2.辣椒红色素是红色辣椒果实的特征类胡萝素，具有强大的抗氧化功能，且现有研究表明，食用红色辣椒能够显著降低死亡率。同时，辣椒红色素还是天然的抗癌物质，在减肥、抗糖尿病、皮肤的光保护、镇痛和消炎、保护心脏和肝脏、降低血脂等方面也具有巨大的潜能。因此，提高辣椒红色素的生物合成率一直是本领域的研究重点。
3.辣椒红色素的生物合成为：由辣椒红色素-辣椒玉红素合成酶(ccs)催化其5,6-环氧类胡萝卜素前体、花药黄素和紫黄质生成。由于ccs基因在辣椒(c.annuum)的棕色和红色成熟过程中高表达，因此ccs在的这两个阶段的转录水平最高。辣椒红色素的生物合成途径具体如图1所示。
4.大量研究表明，花和果实中，类胡萝卜素色素的多样性在很大程度上取决于类胡萝卜素生物合成基因在转录水平上的差异表达。这种差异表达通常涉及多个结构基因或整个类胡萝卜素生物合成途径相应的上调或下调，表明转录因子(tfs)在类胡萝卜素合成中发挥重要作用。
5.由于番茄果实成熟过程中(由于番茄红素的积累)的剧烈颜色变化，以及大量果实颜色突变体的存在，类胡萝卜素的转录控制在番茄中得到了最广泛的研究。几种转录因子(tfs)参与番茄果实成熟过程中类胡萝卜素积累的调节，包括mads盒蛋白rin、tagl1和tdr4，squamosa启动子结合蛋白cnr，hd-zip同源蛋白le-hb1、ap2/erf家族蛋白slap2a和slerf6以及nac结构域蛋白nor、nor-like1和slnac4。然而，上述转录因子(tfs)都具有广泛的成熟效应(例如乙烯合成、果实软化、香气和风味产生)，因此它们不太可能是类胡萝卜素生物合成的特定调节因子。其中一些转录因子(tfs)已被证实与乙烯生物合成基因的启动子直接相互作用，而乙烯在番茄果实成熟期间诱导类胡萝卜素生物合成，说明这些转录因子(tfs)可能通过乙烯信号间接调节类胡萝卜素的产生，而不是直接作用于类胡萝卜素合成途径中的结构基因。
6.其他物种中，参与调控类胡萝卜生物合成的转录因子也相继被鉴定出来。例如拟南芥中bhlh家族的转录因子atpif1和bzip家族的转录因子athy5。这些转录因子能够响应光信号的刺激，并直接结合到类胡萝卜素合成关键限速酶psy的启动子上，负向调控类胡萝卜素的合成。
7.虽然其他物种中参与类胡萝卜素生物合成的相关转录因子陆续被鉴定出来，但是辣椒中类胡萝卜素(辣椒红色素)生物合成的调控机制却鲜有报道。如果能发现直接参与调控辣椒中辣椒红色素生物合成的转录因子，将具有重要的研究价值、育种价值。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供辣椒红色素合成相关myb转录因子及其应用。
9.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：cadiv1转录因子，所述cadiv1转录因子的氨基酸序列如seq no id.2所示。
10.相应的，编码所述cadiv1转录因子的dna。
11.相应的，含有所述转录因子的重组载体。
12.相应的，含有所述dna的表达载体。
13.相应的，含有所述cadiv1转录因子或所述dna的宿主微生物。
14.相应的，所述cadiv1转录因子或所述dna在辣椒红色素合成中的应用。
15.相应的，一种提升辣椒红色素合成量的方法，将所述dna编码到辣椒中。
16.相应的，一种检验辣椒中的辣椒红色素含量的方法，检测辣椒中所述cadiv1转录因子的表达量。
17.本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种和辣椒红色素生物合成高度相关的myb转录因子cadiv1，并通过系列的实验，证明了转录因子cadiv1参与调控辣椒红色素的生物合成，与辣椒红色素的合成量高度正相关。转录因子cadiv1为培育高含量的辣椒红色素新品种提供了新的理论依据和基础，在辣椒育种领域具有重要的应用前景。
附图说明
18.图1为辣椒红色素的生物合成途径示意图；
19.图2为扩增cadiv1的凝胶电泳示意图；
20.图3为含有35s：cadiv1-gfp载体的gv3101农杆菌浸染烟草后的荧光显微镜示意图；
21.图4为cadiv1在本氏烟草中转录激活能力示意图；
22.图5为ptrv1+ptrv2-cadiv1和ptrv1+ptrv2的辣椒红色素液相色谱峰图；
23.图6为cadiv1激活psy、β-ch1和ccs的启动子情况示意图；
24.图7为辣椒红色素在不同材料间的含量差异示意图。
具体实施方式
25.本发明提供了一种和辣椒红色素合成相关myb转录因子cadiv1，所述cadiv1的cdna序列如seq no id.1所示，氨基酸序列如seq no id.2所示，氨基酸序列最后存在终止密码子。cadiv1的蛋白质n端只含有一个myb保守结构域，为1r-myb(myb-related)转录因子，含有典型的shaqk(y/f)f序列，属于divaricata(div)-like蛋白质亚族。cadiv1的转录水平与辣椒红色素的含量呈正相关，在高辣椒红色素材料中的转录水平高于低辣椒红色素材料，在辣椒红色素积累更多的果实部位也体现出更高的转录水平。
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
27.除特别说明外，本发明实施例中样品均来自华南农业大学园艺学院选育的辣椒“59”自交系的辣椒，该辣椒于温室光照12h，黑暗12h，温度25℃环境进行栽培。
28.本发明实施例提取样品总rna的方法为：将所述样品剪切，研磨成粉末状，按照
eastep super总rna提取试剂盒(普洛麦格生物技术有限公司，上海)的说明书提取所述样品组织的总rna。
29.本发明实施例合成第一链cdna的方法为：按照hiseript q rt supermix for gpcr(tgdna wiper)反转录试剂盒的说明书，将提取的总rna反转录合成第一链cdna。
30.实施例一：cadiv1的克隆和序列分析
31.对辣椒“59”自交系果实7个发育时期转录组采用加权共表达网络分析方法，鉴定到一个功能未知的转录因子ca12g06700，其ccs(辣椒红色素合成酶基因)高度共表达。以辣椒“59”自交系红熟期辣椒果肉的cdna为模板，设计引物扩增转录因子ca12g06700的cdna序列全长，分析序列发现编码的蛋白属于r-r型myb家族divaricata亚族，于是将其命名为cadiv1。所述cadiv1的cdna序列如seq no id.1所示，氨基酸序列如seq no id.2所示。
32.扩增cadiv1的引物为：cadiv1-f:atgatgtacacaacgaacaatcggt；cadiv1-r:agaaagaacggaaaagatcgagc。
33.凝胶电泳检测结果如图2所示。将扩增获得的pcr产物经胶回收以后，连接到pmd19-t载体上，转化大肠杆菌。随后挑取菌落pcr为阳性的单克隆菌送公司测序，测序结果显示：cadiv1的cdna序列全长为669bp，编码222个氨基酸。
34.实施例二：cadiv1与辣椒红色素生物合成结构基因表达模式分析
35.分析了提取辣椒“59”自交系不同组织部位和果肉不同发育时期的转录因子cadiv1和辣椒红色素生物合成结构基因的表达模式。结果显示：cadiv1主要在辣椒果实中表达，在绿熟(mg；30dpa)阶段开始启动，在果实破色期(br；33dap)显著上升。这一结果与辣椒红色素的生物合成过程也相匹配：辣椒红色素主要在果肉中积累，且在果实转色期开始大量合成。
36.进一步分析辣椒红色素生物合成过程中的结构基因psy、β-lcy1、zds、β-ch1和ccs在辣椒不同组织部位和果肉不同发育时期的表达模式，发现cadiv1与这些结构基因的表达模式也基本一致，都是在辣椒果肉中的表达量最高，且在辣椒果实破色期(br)开始大量表达。且cadiv1的表达模式与这些结构基因的表达模式更为接近，都是在破色期开始大量表达，在破色期十天后表达量达到顶峰，随后开始下降。证明cadiv1可能参与调控了辣椒果实中辣椒红色素的生物合成。
37.实施例三：cadiv1的亚细胞定位和转录激活
38.1、为了进一步探讨cadiv1的功能，并确定其表达部位，将cadiv1去掉终止密码子后的全长cds序列克隆到含有camv 35s启动子的peaq-egfp载体上，构建获得35s：cadiv1-gfp载体。
39.将构建好的载体转化到gv3101农杆菌中。通过农杆菌介导转化的方法，以细胞核定位基因dsred为参照，将活化后的含有核定位参照的gv3101农杆菌和含有目的基因载体(35s：cadiv1-gfp载体)的gv3101农杆菌按1:1的体积比混合，再将活化后的含有核定位参照的gv3101农杆菌和带有peaq-gfp空载体的农杆菌按1:1的体积比混合(对照)。选取长势一致的烟草，将混合后的两种菌液分别用1ml一次性注射器分别注射到烟草叶片的背面。培养2天后，取注射后的烟草叶片，制作玻片，在荧光显微镜下观察，结果如图3所示。结果显示：注射了35s：cadiv1-gfp载体的烟草叶片只在细胞核中观察到了绿色荧光，而转化了peaq-gfp空载体烟草叶片的细胞核和细胞质中都能观察到绿色荧光信号。结果证明：
cadiv1定位于在细胞核，具有一般转录因子的特点。
40.为了明确cadiv1是否具有转录激活能力，采用双荧光素酶报告系统分析其在生物体内的转录激活活性，通过农杆菌介导法转化烟草，使用酶标仪来检测实验结果，结果如图4所示。结果显示：cadiv1能够显著提高萤火虫荧光素酶的活性，与对照相比提高了4倍，证明cadiv1在植物体内具有转录激活能力。综上，cadiv1是定位于细胞核的具有转录激活能力的转录因子。
41.实施例四：沉默cadiv1基因对辣椒红色素生物合成的影响
42.本实施例通过病毒诱导基因沉默技术，沉默cadiv1基因，降低cadiv1在辣椒中的表达水平。将cadiv1基因全长序列通过在线工具vigs.solgenomics.net,选取同源性较低的区域片段，利用ce design软件设计相应的引物，将cadiv1基因片段克隆到ptrv2载体上，获得ptrv2-cadiv1载体，以ptrv2空载体为对照，以ptrv1为辅助，将各载体分别转化农杆菌。通过农杆菌介导转化的方法分别转化辣椒幼苗，具体方法为：将带有ptrv1的农杆菌和ptrv2-cadiv1的农杆菌按1:1体积比混合(ptrv1+ptrv2-cadiv1)，再将带有ptrv1的农杆菌与带有ptrv2的农杆菌按1:1的体积比混合作为对照(ptrv1+ptrv2空载体)。通过一次性注射器分别将各混合菌液注射到子叶展平幼苗时期的“59”自交系辣椒植株的叶片背面。
43.将处理后的各辣椒幼苗在同一温光条件下(20℃恒温保湿培养，黑暗处理48h后给予光照)培养至开花期，每个植株都进行人工授粉，并记录好坐果时期。
44.结果显示：与对照组植株(ptrv1+ptrv2空载体)相比，ptrv1+ptrv2-cadiv1处理组的植株辣椒果实会推迟3～4天变色，当对照组果实进入破色期的时候，ptrv2-cadiv1处理组的果实尚处于绿熟期。当对照组果实进入红熟期的时候，ptrv2-cadiv1处理组有的果实却还是橙红色，而不是对照组红熟辣椒果实的鲜红色，还有的着色明显不完全尚有叶绿素残留。因专利无法提供彩色图片，故文中不提供各植株的颜色对比图。
45.进一步提取对照组植株和ptrv1+ptrv2-cadiv1沉默植株辣椒果实的破色期果肉，提取rna，通过荧光定量分析cadiv1和辣椒红色素生物合成结构基因的表达量。结果显示：与对照植株相比，ptrv1+ptrv2-cadiv1沉默植株的cadiv1表达量显著下降。进一步分析发现，cadiv1被有效沉默的株系中的辣椒红色素生物合成相关的结构基因表达量也相应的降低了50％以上。
46.为进一步探究沉默cadiv1对辣椒果实中辣椒红色素生物合成的影响，分别取对照组和ptrv1+ptrv2-cadiv1实验组红熟期辣椒果肉，于冷冻干燥机冻干后，采用有机溶剂萃取的方法提取辣椒红色素，并用高效液相色谱的方法去测定辣椒红色素的含量，通过标准样品的校正，可以确定辣椒红色素出峰时间为11分钟前后，ptrv1+ptrv2-cadiv1和ptrv1+ptrv2的液相色谱峰图如图5所示，结果显示：与对照相比，ptrv1+ptrv2-cadiv1的辣椒红色素所对应的出峰高度要更低，说明其辣椒红色素含量更低。
47.进一步通过标准曲线得出的计算公式计算辣椒红色素含量，与对照组相比，cadiv1沉默的株系红熟期辣椒果肉中的辣椒红色素含量下降了约50％。
48.综上，cadiv1的表达水平与辣椒果实中的辣椒红色素含量紧密相关，沉默cadiv1会导致辣椒红色素生物合成结构基因的表达也相应降低，进而导致辣椒果实中辣椒红色素的含量下降，影响果实的着色，证明cadiv1参与调控辣椒红色素的生物合成。
49.实施例五：cadiv1对辣椒红色素生物合成相关基因的激活作用
50.根据实施例四，病毒诱导沉默cadiv1后，辣椒中辣椒红色素生物合成结构基因psy、β-ch1和ccs的表达量都出现了不同程度的下降。本实施例采用了双荧光素酶系统来分析cadiv1对上述基因的调控以及在生物体内对这些基因启动子的激活活性。
51.首先将辣椒红色素合成结构基因psy、β-ch1和ccs的启动子分别构建到pgeenii-0800-luc载体上，将cadiv1构建到peaq载体上，然后将构建好的载体通过农杆菌侵染的方法转化到烟草体内，转化方法为：将各含有辣椒红色素合成关键结构基因启动子序列的报告基因载体和含有cadiv1转录因子cds序列的表达载体按照1:10的菌液体积比混合摇匀，用没有针头的1ml注射器轻轻对叶片进行摩擦并将混合菌液中注射到本氏烟草完全展开的叶片上，使叶片都充满水渍。注射完毕后放于25℃，黑暗条件下培养24h，之后转移至光照条件培养3天。同时用peaq空载体替代含有cadiv1转录因子cds序列的表达载体，其余条件完全相同，进行相同试验，作为对照。
52.3天后，按照双荧光素酶系统检测试剂盒的指示，在酶标仪上测定相应的数据。结果如图6所示，表明cadiv1能够显著激活psy、β-ch1和ccs三个基因的启动子，与空载体(peaq)对照相比，其激活能力提高了2～4倍。证明cadiv1在生物体内具有启动子激活活性，能够激活辣椒红色素生物合成结构基因的启动子转录，进而调控辣椒红色素的生物合成。
53.实施例六：cadiv1表达对辣椒红色素含量指示作用
54.选择20个辣椒红色素含量不同的品种(系)(分别为：41、43、48、59、ca1、ca2、ca3、ca4、ca5、ca6、cf1、cf2、cf6、678、732、lxj1、ydh、bj、hl13、hl23)。取各辣椒完熟期的辣椒果肉，一部分提取rna，反转录成cdna保存于-20℃，用于后续的定量分析实验；另一部分冻干，用有机溶剂萃取的方法提取辣椒红色素，并用高效液相色谱的方法测定辣椒红色素含量，结果如图7所示，辣椒红色素在不同材料间的含量存在明显差异。
55.根据cadiv1的cds序列设计荧光定量pcr引物，pcr引物为：qdiv1-f:gggctggacaaatacgggaa；qdiv1-r:tccactgcggtggtaatgtc。以上述提取的各辣椒的cdna为模板，进行荧光定量实验。结果参见图7：cadiv1表达量和辣椒红色素含量显著相关，证实cadiv1参与辣椒红色素生物合成，同时该基因表达可以用作为辣椒红色素指示。
56.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。