用于非洲猪瘟的酿酒酵母口服疫苗及应用的制作方法

本发明属于生物基因工程，具体涉及用于非洲猪瘟的酿酒酵母口服疫苗及应用。

背景技术：

0、技术背景

1、asfv是一种单股、两端共价连接的双链dna病毒，具有二十面体结构，基因组全长约170kb～190kb，asfv基因组庞大，有超过一半的基因功能未知，保护性抗原基因研究不足，生物学特性复杂，其诱导的免疫保护及免疫逃逸机制研究十分有限；病毒致弱与免疫保护之间难以平衡，如毒力基因往往又是保护性抗原基因；病毒的增殖、分离需要用猪原代细胞，同时需要在生物安全三级以上实验室进行，研发费用较高，正是以上种种原因使得该病毒的疫苗研究进展缓慢。

2、传统病毒疫苗可通过病毒灭活和病毒致弱两种方法进行制备。

3、迄今为止，采用多种传统方法制备的asf灭活疫苗均不能对强毒攻击提供有效的免疫保护，虽然用asf灭活疫苗免疫后可产生高效价的抗体，但很难检测到中和抗体的存在。blome s等研究表明，使用新型佐剂polygen或emulsigen d等与asfv灭活抗原(armenia08株)进行配伍，免疫动物后能够诱导产生asfv特异性抗体，但仍未能提高疫苗的免疫保护效力。

4、弱毒疫苗及基因编辑的基因缺失疫苗依然存在安全隐患。减毒活疫苗能够诱导强烈持久的免疫应答，但生物安全是其使用的主要限制因素。asfv可经过猪骨髓来源细胞、vero和cos-1等细胞系传代致弱。传代过程中，asfv致病力逐渐下降，同时病毒免疫原性和稳定性也随之下降。在西班牙和葡萄牙，使用传代致弱毒株免疫动物后产生了灾难性的后果，免疫动物呈现出肺炎、流产和死亡等副作用，在田间多次感染和异源强毒株存在的条件下，许多免疫动物呈现asf慢性感染临床症状。采用天然致弱asfv毒株ourt88/3或nh/p68免疫动物后，能诱导产生对同源强毒株的攻毒保护，然而，天然致弱毒株免疫动物后可造成诸多副反应，包括肺炎、流产、死亡等，免疫nh/p68毒株后25％～47％的猪呈现慢性感染；免疫ourt88/3后可导致发热、关节肿胀等症状。总之，天然致弱毒株导致的诸多副反应以及存在散毒的可能性等生物安全隐患限制了其在实际生产中的进一步应用。

5、敲除病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因，可降低病毒毒力或增加机体对病毒的免疫应答，研制比传统弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程活疫苗。研究表明一些asfv毒株在缺失单个或多个毒力基因或免疫抑制基因后，如tk(k196r)、9gl(b119l)、cd2v(ep402r)、dp148r、nl(dp71l)、uk(dp96r)和多基因家族360和505(mgf360/505)，缺失毒株接种宿主毒力减弱且可诱导产生针对同源母本毒株或异源毒株的特异性免疫保护，但是安全性和有效性与病毒毒株、免疫或感染剂量、病毒接种途径以及接种动物密切相关，安全性和有效性是影响asf弱毒活疫苗田间应用的重要因素，基因缺失减毒株田间使用中潜在的交叉重组可能导致毒力返强，也是潜在的安全风险。因此，致弱毒株保护性的强弱、是否有毒力残留和是否导致持续感染是弱毒活毒株能否成为候选疫苗毒株的重要决定因素。

6、目前报告的亚单位疫苗及病毒活载体疫苗保护效力不够。

7、asf亚单位疫苗只包含特定的病毒抗原，没有病毒的核酸，安全可靠。研究表明，针对病毒p30蛋白的抗体在细胞水平抑制超过95％的asfv内化，p72和p54的抗体能够抑制病毒吸附，表明这些蛋白在asfv感染中发挥作用。用重组p30或p54蛋白免疫猪后可以诱导中和抗体的产生，但不能提供针对急性asf感染的保护；相比之下，同时免疫p30和p54蛋白或两种蛋白的嵌合体可以提供部分保护。用杆状病毒表达系统制备的asfv结构蛋白p72、p30和p54等，以蛋白复合物作为抗原免疫动物后仍不能提供有效的免疫攻毒保护，说明仅仅依靠上述抗原刺激产生的中和抗体很难获得理想的免疫保护效果。

8、非洲猪瘟活载体疫苗的研究，目前主要选用腺病毒(adenovirus)、痘病毒(poxviuses)、伪狂犬病毒(pseudorabies)、甲病毒(alphavirus)等载体表达asfv主要的抗原基因，以期诱导产生细胞免疫和ctl应答。其中腺病毒(adenovirus)研究使用较为广泛，lokhandwala等将asfvp32、p54、p72和pp62基因分别重组入人腺病毒ad5载体中进行“鸡尾酒”式免疫，获得了良好的抗原特异性ctl反应；之后他们又将asfva151r、b119l、b602l、ep402rδprr、b438l和k205r-a104r共7个asfv抗原基因，重组入复制缺陷型腺病毒载体，通过“鸡尾酒”式混合免疫后能够诱导强烈体液免疫反应和细胞免疫应答，后续进一步将两种佐剂biomize或zts-01与9种重组腺病毒(a151r,b119 l,b602 l,ep402rδprr,b438l,k205r-a104r,p32,p54,pp62和p72)分别混合免疫，攻毒后免疫组80％的猪全部发病并死亡，没有免疫保护。goatley等研究8种重组腺病毒(b602l,b646l(p72),cp204l(p30),e183l(p54),e199l,ep153r(c-type lectin),f317l and mgf505-5r)免疫猪群，携带同样8个非洲猪瘟抗原的重组mva病毒(安卡拉痘苗弱毒)进行加强免疫，攻毒后7天免疫组5头猪全部存活，保护率达到了100％，这些研究表明选择非洲猪瘟的有效抗原组合十分重要，但是该报告使用的动物数量较少，攻毒后的观察期较短，猪内脏器官依然有不同程度带毒，疫苗组合分别由2种病毒活载体构成，细胞培养成本高昂，需要突破2种病毒载体的悬浮工艺培养，依然面临着高剂量注射引起的潜在应激反应，这些可能限制了该疫苗组合的进一步开发及使用。

9、酿酒酵母展示作为口服疫苗的递送载体安全无毒，口服无应激；可以耐受一定的胃酸消化分解，为生物大分子透过提供保护。schreuder m p等在酿酒酵母表面表达乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)的pres序列，小鼠腹腔免疫后抗体反应较弱，可能与细胞壁表面抗原的表达量不高有关；kim,j.m等将胸膜肺炎放线杆菌的毒素蛋白apxiia展示到酿酒酵母表面，全菌喂服小鼠后，可以抵御一定剂量的胸膜肺炎放线杆菌的感染。lei h等以高致病性禽流感h7n9作为研究对象。口服免疫重组酿酒酵母表面展示ha抗原n端584个氨基酸，经小鼠口服免疫后，存活率达到100％。chen c等将非洲猪瘟抗原p54,p30分别与iga,igg恒定区fc段融合，成功展示到酿酒酵母表面，免疫仔猪后产生了黏膜特异性免疫的iga，但是iga抗体效价均很低，有可能是蛋白融合后表达量降低，融合蛋白检测也发生了明显的断裂，产生很多非特异性条带，该报告虽未做攻毒保护实验，但从以往包含p54,p30抗原的疫苗研究中，不管是病毒活载体或亚单位疫苗均未获得有效保护。

10、可以看到酿酒酵母表面展示的口服疫苗已在水产，畜禽疾病防控上进行了有意义的探索，但依然存在以下问题：

11、1.口服免疫的效果具有不稳定性，尤其是群体免疫具有不均匀性；

12、2.酿酒酵母表面展示抗原的表达量直接影响了免疫反应的强度，不同的抗原在酿酒酵母表面展示的量有差异，同一抗原在融合或截短中都会影响展示的表达量，选择不同的表面锚定gpi也影响了蛋白的正确展示；

13、3.抗原的选择、免疫剂量及方式也同样影响免疫的实际效果，而且口服免疫需要经过胃肠道，需要给予足够的剂量，使到达肠道中的酿酒酵母达到有效免疫的浓度，这些都因免疫对象的差异而明显不同；

14、4.口服产生的黏膜免疫保护机制及评价指标依然有待深入研究。这些问题都限制了酿酒酵母口服疫苗的临床批准和广泛使用。

15、针对上述问题，申请人通过对非洲猪瘟抗原的初步筛选，优选8个抗原进行组合；其中p72是主要的核衣壳蛋白，在病毒感染复制期分子伴侣b602l协助p72组装为有功能的三聚体单元，进一步与其它衣壳组分形成完整的衣壳；外囊膜蛋白为cd2v为血凝相关抗原，为毒力基因，内囊膜蛋白分别有p54(e183l编码)，p22(kp177r)，pe199l,pe248r,p12(o61r)，p17(d117l)等蛋白，这些蛋白在非洲猪瘟病毒的吸附、内化、胞吞及膜融合中起到重要的作用；然而这些蛋白大多具有跨膜区、核定位信号或内质网定位信号，因此不利于蛋白的表面展示，通过对这些蛋白的抗原区的生物学分析和免疫学鉴定，将其关键的抗原免疫区高效地展示在酿酒酵母表面，以口服途径免疫猪只，提高免疫猪的黏膜免疫屏障，从而有效防范非洲猪瘟病毒的吸附和侵入。

16、blome s,gabriel c,beer m.modern adjuvants do not enhance the efficacyof an inactivated african swine fever virus vaccinepreparation.vaccine.2014jun 30；32(31):3879-82.

17、lokhandwala s,petrovan v,popescu l,sangewar n,elijah c,stoian a,olcham,ennen l,bray j,bishop rp,waghela sd,sheahan m,rowland rrr,mwangiw.adenovirus-vectored african swine fever virus antigen cocktails areimmunogenic but not protective against intranasal challenge with georgia2007/1isolate.vet microbiol.2019aug；235:10-20.

18、goatley lc,reis al,portugal r,goldswain h,shimmon gl,hargreaves z,hocs,montoya m,sánchez-cordón pj,taylor g,dixon lk,netherton cl.a pool of eightvirally vectored african swine fever antigens protect pigs against fataldisease.vaccines(basel).2020may 18；8(2):234.

19、schreuder mp,deen c,boersma wj,pouwels ph,klis fm.yeast expressinghepatitis b virus surface antigen determinants on its surface:implicationsfor a possible oral vaccine.vaccine.1996apr；14(5):383-8.

20、kim jm,jung di,eom yj,park sm,yoo hs,jang ys,yang ms,kim dh.surface-displayed expression of a neutralizing epitope of apxiia exotoxin insaccharomyces cerevisiae and oral administration of it for protective immuneresponses against challenge by actinobacillus pleuropneumoniae.bioscibiotechnol biochem.

21、2010；74(7):1362-7.doi:10.1271/bbb.90941.epub 2010jul 7.pmid:20622458.

22、lei h,xie b,gao t,cen q,ren y.yeast display platform technology toprepare oral vaccine against lethal h7n9 virus challenge in mice.microb cellfact.2020mar 2；19(1):53.doi:10.1186/s12934-020-01316-1.pmid:32122351；pmcid:pmc7053147.

23、chen c,hua d,shi j,tan z,zhu m,tan k,zhang l,huang j.porcineimmunoglobulin fc fused p30/p54protein of african swine fever virusdisplaying on surface of s.cerevisiae elicit strong antibody production inswine.virol sin.2021apr；36(2):207-219.

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供用于非洲猪瘟的酿酒酵母口服疫苗，本发明的口服疫苗，为重组酿酒酵母混合物，是将分别表达b602l(seq id no.9所示),p54(seq id no.10所示),p22(seq id no.11所示)，p17-p12(seq id no.12所示),pe199l(seq id no.13所示),cd2v(seq id no.14所示),pe120r(seq id no.15所示)和pe248r(seq id no.16所示)的重组酵母混合而成。

2、本发的另一个目的在于提供用于非洲猪瘟的酿酒酵母口服疫苗的应用。

3、为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

4、用于非洲猪瘟的酿酒酵母口服疫苗，包括8个重组酵母，所述的重组酵母，是将编码非洲猪瘟蛋白b602l(seq id no.9所示),p54(seq id no.10所示),p22(seq id no.11所示)，p17-p12(seq id no.12所示),pe199l(seq id no.13所示),cd2v(seq id no.14所示),pe120r(seq id no.15所示)和pe248r(seq id no.16所示)基因分别转入酿酒酵母eby100中获得。

5、用于非洲猪瘟的酿酒酵母口服疫苗在制备治疗或预防非洲猪瘟疫苗中的应用，是将分别表达b602l、p54、p22、p17-p12、pe199l、cd2v、pe120r和pe248r的重组酵母依次按照菌量比例1～2：1～2：1～2：1～2：1～3：1～3：1～3：1～3的比例混合后，猪只进行口服。

6、以上所述的应用中，优选的，所述的非洲猪瘟由非洲猪瘟病毒(african swinefever virus)sy-1(保藏编号：cctcc no：v202154)引起。所述的非洲猪瘟病毒(africanswine fever virus)sy-1已于2021年06月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：cctcc no：v202154

7、与现有技术相比，本发明的有益效果：

8、1.本发明首次提供了可口服的非洲猪瘟疫苗，攻毒后，28天日观察疫苗的保护率可以达到80％。

9、2.本发明对非洲猪瘟的9个抗原进行了有效截短，其中对两个抗原进行了融合，制备了8个酿酒酵母抗原展示株。

10、3.免疫方式简单，口服拌料容易规模化实施，避免注射引起的应激反应，可以有效的预防非洲猪瘟病毒的黏膜组织感染。

11、4.免疫攻毒后口腔、鼻腔及肛门等黏膜组织几乎不排毒；结果表明免疫组产生了有效的黏膜保护能力，抵御了一定致死毒量的非洲猪瘟病毒的口服感染。