一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶B亚基点突变类型的引物组、试剂盒和方法

一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的引物组、试剂盒和方法
技术领域
1.本发明涉及农业科学技术领域，具体而言，涉及一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的引物组、试剂盒和方法。


背景技术：

2.灰葡萄孢菌(botrytis cinerea pers.)又称灰霉菌，是一种寄主广、危害性大的植物病原菌。它能引起草莓、葡萄、番茄、黄瓜等多种重要农作物的灰霉病(gray mold disease)，导致植株或果实霉变、腐烂等症状，造成巨大经济损失。
3.灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶(sdh)，又叫线粒体呼吸链复合物ii，是三羧酸循环中的关键膜复合物，能催化琥珀酸和延胡索酸相互转化中转移的偶联反应。它由黄素蛋白(sdh a)、铁硫蛋白(sdh b)和另外2种嵌膜蛋白(sdh c和sdh d)4个亚单位组成。琥珀酸脱氢酶抑制剂(sdhis)是一类以sdh基因作为靶点的杀菌剂，它能与sdh的泛醌结合位点结合，干扰sdh的电子传递，阻止能量产生，从而抑制病原菌的生长，达到防治病害的效果。尽管sdhis对多种病原菌有很高的抑菌活性，由于靶标的作用位点单一和该靶标较高的变异性，杀菌剂抗性行动委员会(fungicides resistance action committee，frac)将sdhis杀菌剂归为中高抗性风险，目前已有10多种病原菌对sdhis杀菌剂存在抗性。
4.灰葡萄孢菌的sdh b已报道的田间或室内突变类型已经有7种之多：如p225l/f/t(第225位的脯氨酸突变为亮氨酸、苯丙氨酸或苏氨酸)、n230i(第230位的天冬酰胺突变为异亮氨酸)或h272l/r/y(第272位的组氨酸突变为亮氨酸、精氨酸或酪氨酸)。啶酰菌胺等作为作用于sdh b的sdhi，也被frac认定为是具有高度抗性风险的病原菌-杀菌剂组合。中国、美国、德国等多个国家均已出现田间b.cinerea对啶酰菌胺产生抗性的报道，并伴随防治效果下降。
5.因此，通过检测灰葡萄孢菌的sdh b的突变与否，能掌握其抗性产生原因，亦能指导田间合理使用农药。但是目前，缺乏同时检测灰葡萄孢菌sdh b 7种突变类型的相关试剂和方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的引物组、试剂盒和方法，从而解决现有技术中缺乏同时检测灰葡萄孢菌sdh b 7种突变类型的相关试剂和方法的问题。
7.为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
8.根据本发明的第一方面，提供了一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的引物组，其包括如下引物组合中的一种或多种：引物组合1、引物组合2和引物组合3；其中，引物组合1包括：seq id no.1和seq id no.2所示的引物；引物组合2包括：seq id no.1和seq id no.3所示的引物；引物组合3包括：seq id no.4和seq id no.5所示的引物。
9.b.cinerea最常见的突变位点为225位点(脯氨酸)、230位点(天冬酰胺)与272位点(组氨酸)，包括p225f/t/l、n230i与h272y/r/l等突变类型，p225f、n230i、h272r、h272y等为我国最常见的抗性突变类型。
10.衍生酶切扩增多态性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequences，dcaps)方法是一种检测等位基因、snp、突变位点的简单、高效、准确的方法，通过使用存在几个碱基错配的pcr引物对目标区间进行扩增，从而引入酶切位点或突变掉序列上原有的酶切位点，然后用特定的限制性内切酶进行酶切，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)或琼脂糖电泳来判断片段的位点突变与否。
11.基于dcaps技术结合灰葡萄孢菌shd b的7种突变类型p225f(ccc突变为ttc)、p225t(ccc突变为acc)、p225l(ccc突变为ctt)、n230i(aac突变为atc)、h272r(cac突变为cgc)、h272y(cac突变为tac)、h272l(cac突变为ctc)，本发明的发明人设计出针对sdh b亚基的上述3个突变位点(225、230和272)的7种突变类型(p225f/t/l、n230i、h272r/y/l)的含有5条引物的3对引物组合用于灰葡萄孢菌sdh b突变类型检测。
12.采用引物组合1可以特异性扩增灰葡萄孢菌shd b部分片段，pcr产物直接通过限制性内切酶scr fi酶切，酶切产物在1.5％-2.0％的琼脂糖凝胶电泳下，能区别野生敏感菌株(不具有抗性的)与225位点突变dna(p225f/t/l)，用于灰葡萄孢的sdh b的突变和抗性进行初步检测。
13.野生型的敏感菌株dna的pcr产物能被限制性内切酶scr fi切短，而225位点发生突变菌株dna的pcr产物不能被scr fi所酶切，在1.5％-2.0％的凝胶电泳结果很容易区别。该引物组合1包括：
14.p-dcaps-f1：
[0015]5’‑
ctacaagcaatacaagtccattaagc-3’(seq id no.1)；
[0016]
p-225dcaps-r：
[0017]5’‑
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtactcctcactgttccaccagtagcc-3’(seq id no.2)。
[0018]
采用引物组合2可以特异性扩增灰葡萄孢菌shd b部分片段，pcr产物直接通过限制性内切酶bam hi酶切，酶切产物在1.5％-2.0％的琼脂糖凝胶电泳下，能区别野生敏感菌株(不具有抗性的)与230位点突变菌株(n230i)，用于灰葡萄孢的sdh b的突变和抗性进行初步检测。
[0019]
230位点发生突变菌株dna的pcr产物能被限制性内切酶bam hi切短，而野生型的敏感菌株dna的pcr产物不能被bam hi所酶切，在1.5％-2.0％的凝胶电泳结果很容易区别。
[0020]
该引物组合2包括：
[0021]
p-dcaps-f1：
[0022]5’‑
ctacaagcaatacaagtccattaagc-3’(seq id no.1)；
[0023]
p-230dcaps-r：
[0024]5’‑
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagatagctggtcccaagtactcctcacgg-3’(seq id no.3)。
[0025]
采用引物组合3可以特异性扩增灰葡萄孢菌shdb部分片段，pcr产物直接通过限制性内切酶dra iii酶切，酶切产物在1.5％-2.0％的琼脂糖凝胶电泳下，能区别野生敏感菌
株(不具有抗性的)与272位点突变菌株(h272r/y/l)，用于灰葡萄孢sdh b的突变和抗性进行初步检测。
[0026]
野生型的敏感菌株dna的pcr产物能被限制性内切酶dra iii切短，而272位点发生突变菌株dna的pcr产物不能被dra iii所酶切，在1.5％-2.0％的凝胶电泳结果很容易区别。
[0027]
该引物组合3包括：
[0028]
p-dcaps-f2：
[0029]5’‑
cctcctactggtggaacagtgag-3’(seq id no.4)；
[0030]
p-272dcaps-r：
[0031]5’‑
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggacatgtcctcgagcagttgagcacagtg-3’(seq id no.5)。
[0032]
根据本发明的第二方面，提供一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的试剂盒，其包括上述的引物组。
[0033]
进一步地，在本发明的一些实施方案中，该试剂盒还包括pcr反应缓冲液和酶切反应缓冲液。
[0034]
该pcr反应缓冲液含有：taq dna聚合酶、mg
2+
和dntps(北京全式金生物技术有限公司)。
[0035]
该酶切反应缓冲液含有：限制性内切酶、缓冲液rcutsmart(新英格兰实验室)。
[0036]
该试剂盒可快速、有效地鉴别灰葡萄孢菌shd b的突变类型，具有操作简单、结果准确的特点，为杀菌剂的科学使用和灰霉病菌的高效防控提供保障。
[0037]
根据本发明的第三方面，提供一种检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的方法，其包括如下步骤中的任意一个步骤：步骤s1：使用引物组合1对待测样品进行pcr，pcr产物用scr fi进行酶切；步骤s2：使用引物组合2对待测样品进行pcr，pcr产物用bam hi进行酶切；以及，步骤s3：使用引物组合3对待测样品进行pcr，pcr产物用dra iii进行酶切；其中，引物组合1包括：seq id no.1和seq id no.2所示的引物；引物组合2包括：seq id no.1和seq id no.3所示的引物；引物组合3包括：seq id no.4和seq id no.5所示的引物。
[0038]
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤s1，s2，s3中，进行pcr时，退火温度设置为58-60℃。
[0039]
进一步地，在步骤s1，s2，s3中，进行pcr时，循环数设置为30-35个循环。
[0040]
根据本发明的一些实施方案中，在步骤s1，s2，s3中，使用引物组合1、2、3进行pcr的程序包括：变性：95℃、20s，退火：58℃、20s，延伸：72℃、20s，30个循环；在步骤s1，s2，s3中，使用引物组合1，2，3的pcr产物的酶切程序包括：37℃、10min，失活65℃、5min。
[0041]
本发明提供的检测灰葡萄孢菌的sdh b点突变类型的引物组，利用3对引物组合对sdh b扩增，然后特殊的酶切，通过条带差异，快速、有效地鉴别sdh b的突变类型，对7种突变类型进行鉴别，操作简单，费用低廉，为杀菌剂的科学使用和灰霉病菌的高效防控提供保障。
[0042]
此外，本发明所提供的引物组中的下游引物中巧妙的引入25个腺嘌呤a碱基，使得切割后片段差异明显和便于观察，即使不使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)，仅用1.5％的琼
脂糖凝胶电泳也能容易区分敏感或突变型的菌株；此发明无需测序即能检测突变类型。以上这些都可大大提高检测的效率。
[0043]
采用该引物组可以快速、有效地鉴别对灰葡萄孢菌的sdh b的突变类型。
[0044]
综上所述，根据本发明提供的检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的引物组、试剂盒和方法具有以下优点：
[0045]
1)检测范围广：涉及所有国内外已报道的sdh b突变类型。
[0046]
2)高效：传统的抗性鉴定方法往往依赖于对病原菌的培养，通过药剂对病原菌的抑制作用来判断抗药性情况，耗时一般在7d左右；本发明无需对病原菌进行培养等试验，直接通过基因组dna的pcr、酶切，能够在2-3小时内完成抗性情况的鉴定，且能有效区别敏感菌株及7种抗性突变菌株。
[0047]
3)设计巧妙：在225、272突变位点检测的反向引物中，引入含酶切位点的突变，避开了其他3种突变类型的特定序列，使得在酶切后仅能有效酶切敏感菌株的pcr产物，不需要针对每一个突变类型进行引物设计和检测，减少检测工作量；在突变引物上加入25个腺嘌呤a碱基，使得切割后片段差异明显和便于观察。
[0048]
4)操作简便、成本低廉：本发明仅仅需pcr扩增仪、电泳槽等常规仪器以及pcr扩增反应、酶切所需的常规试剂，价格低廉。
[0049]
caps和dcaps常用于等位基因、snp、抗病基因等位点的检测，本发明首次将dcaps技术应用于病原菌突变的检测，能快速、高效、便捷的检测病原菌的抗药性突变类型，无需对病原菌进行分离、纯化、培养等繁琐操作；检测碱基突变的方法还有arms-pcr等，但是arms-pcr的缺点是不能检测未知的突变和gc含量太高或太低突变，而dcaps技术不限于这些缺点，能检测该点的多种突变，且引物设计不受gc含量的限制。病原菌的突变检测对指导农业生产用药有重要的实际应用，减少农药浪费、减少农药残留、保护生态环境等方面都具有重大意义。
[0050]
因此，根据本发明提供的引物组、试剂盒和检测方法具有非常高的实用价值。
附图说明
[0051]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0052]
图1为灰葡萄孢菌sdh b亚基野生敏感型及突变的序列展示；
[0053]
图2为灰葡萄孢菌sdh b突变位点引物设计图，其中：a为sdh b 225突变位点引物设计图，b为sdh b 230突变位点引物设计图，c为sdhb 272突变位点引物设计图，其中：突变位点用深色字体突出表示，引物特异性的突变在引物中示出，酶切位点在最下方用斜体字体突出表示；
[0054]
图3为引物组1检测灰葡萄孢菌sdh b 225位点突变的1.5％琼脂糖凝胶电泳图，其中m：其中m：marker；1、敏感的无突变菌株；2、3、4：p225f/t/l抗性突变dna；5：n230i抗性突变dna；6、7、8：h272r/y/l抗性突变dna；
[0055]
图4为引物组2检测灰葡萄孢菌sdhb 230位点突变的1.5％琼脂糖凝胶电泳图，其
中m：marker；1、敏感的无突变菌株；2、3、4：p225f/t/l抗性突变dna；5：n230i抗性突变dna；6、7、8：h272r/y/l抗性突变dna；
[0056]
图5为引物组3检测灰葡萄孢菌sdh b 272位点突变的1.5％琼脂糖凝胶电泳图，其中m：marker；1、敏感的无突变菌株；2、3、4：p225f/t/l抗性突变dna；5：n230i抗性突变dna；6、7、8：h272r/y/l抗性突变dna；
[0057]
图6为引物组1,2,3检测灰葡萄孢菌sdh b突变的1.5％琼脂糖凝胶电泳图，其中a为引物组合1检测；b为引物组合2检测；c为引物组合3检测；m：marker；1、2、3、4：敏感无突变菌株(pd6，qp2，qp5，qp6)；5、6、7、8：p225f抗性突变菌株(fx1-15，pd1-7，fx1-7，fx1-11)；9、10、11、12：n230i抗性突变菌株(pd1-3，jd1-2，fx1-1，pd1-1)；13、14、15、16：h272r抗性突变菌株(js41，js41)，h272y抗性突变菌株(fx35，fx37)。
具体实施方式
[0058]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0059]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0060]
实施例1灰葡萄孢菌sdh b敏感菌株、抗性突变dna的获得
[0061]
本实施例以灰葡萄孢菌sdh b野生敏感型菌株为出发菌株，采用植物基因组dna提取试剂盒(货号：dp305，天根生化科技(北京)有限公司)，按操作方法进行病原菌dna提取，sdh b基因序列长度为962bp，核苷酸序列如seq id no.6所示：atggctgctctccgcacaggtgcccgcagtgcacgcgcgatattcgccgcatcacgaccagctttcagaactcagatgcgaaccatggcatcagtcgacagctcagtacctgaaagtcctaccgtttctccatcccgtcctgtcgaatctgcttccaagacctccactgtcaaggaacctgctgccgactcggagtctttgatcaagacattcaacatttacagatggaacccagatgagccaaccagcaagccccgcatgcaatcttacactttggatctcaacaagactggacctatgatgttggatgcgcttattagaatcaagaatgaggtcgaccctacccttacattcagaagatcttgcagagaaggtatctgcggcagttgtgcaatgaacattgatggagtaaacacattggcttgcttgtgtatgttaatcaactattcaatattaaaacacatttgctgaccatttattctacaggccgcattccaagagacgctaagcacgaaacgaagatctacccactaccccacacctatgtcgtcaaggatattgttccagatttgacacaattctacaagcaatacaagtccattaagccatatcttcaacacaccgacccagcaccagaaggaaaagaatacttgcaatctaaggaggatcgtaagaagcttgatggactttacgaatgtattctctgcgcatgctgctcgacatcttgcccctcctactggtggaacagtgaggagtacttgggaccagctatcttgttgcagagttacagatggcttgcagattcccgtgatcagaagaaggaagaacgtaaggcagctttggataacagcatgagtttgtacagatgtcaccacactattctcaactgctcgaggacatgtccgaagggattgaatcctggtttggcaattgcggagattaagaaggaaatggctttctaa
[0062]
根据7种突变类型(p225f/t/l、n230i、h272r/y/l)的突变序列(如图1中所示)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成制备p225f、p225t、p225l、n230i、h272r、h272y、h272l突变dna。
[0063]
实施例2引物组的设计
[0064]
在本实施例中，发明人根据7种突变类型(p225f/t/l、n230i、h272r/y/l)的突变序
列进行引物设计。
[0065]
2.1引物组合1
[0066]
根据灰葡萄孢菌的sdh b亚基3种225位点突变类型上下游设计特异性引物，并在下游引物的3’端引入突变，使得敏感菌株的pcr产物能被scr fi识别，而抗性dna的pcr产物不能被酶切如图2中的a所示。
[0067]
设计出的引物组合1包括：
[0068]
p-dcaps-f1：
[0069]5’‑
ctacaagcaatacaagtccattaagc-3’(seq id no.1)；
[0070]
p-225dcaps-r：
[0071]5’‑
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtactcctcactgttccaccagtagcc-3’(seq id no.2)。
[0072]
2.2引物组合2
[0073]
根据灰葡萄孢菌的sdh b亚基230位点突变类型上下游设计特异性引物，并在下游引物的3’端引入突变，使得抗性dna的pcr产物能被bam hi识别，而敏感菌株的pcr产物不能被酶切，如图2中的b所示。
[0074]
该引物组合2包括：
[0075]
p-dcaps-f1：
[0076]5’‑
ctacaagcaatacaagtccattaagc-3’(seq id no.1)；
[0077]
p-230dcaps-r：
[0078]5’‑
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagatagctggtcccaagtactcctcacgg-3’(seq id no.3)。
[0079]
2.2引物组合3
[0080]
根据灰葡萄孢菌的sdh b亚基272位点突变类型上下游设计特异性引物，并在下游引物的3’端引入突变，使得敏感菌株的pcr产物能被dra iii识别，而抗性dna的pcr产物不能被酶切，如图2中的c所示。
[0081]
该引物组合3包括：
[0082]
p-dcaps-f2：
[0083]5’‑
cctcctactggtggaacagtgag-3’(seq id no.4)；
[0084]
p-272dcaps-r：
[0085]5’‑
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggacatgtcctcgagcagttgagcacagtg-3’(seq id no.5)。
[0086]
实施例3
[0087]
应用引物组合1对待测样品进行pcr扩增；pcr体系均为50.0μl，含1/2体积的2
×
pcr supermix(北京全式金生物)、引物各0.25μmol及dna10.0ng。pcr程序为：预变性95℃3min；95℃20s、58℃20s及72℃20s，循环30次；最后72℃延伸5min。pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。酶切反应体系为50.0μl，含pcr产物15.0μl，rcutsmart buffer 5.0μl，scr fi1.0μl。酶切反应为37℃15min。取10.0μl酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，与预期相符。
[0088]
应用引物组合2对待测样品进行pcr扩增；反应同上。酶切反应体系为50.0μl，含
pcr产物15.0μl，rcutsmart buffer 5.0μl，bam hi 1.0μl。酶切反应为37℃15min。取10.0μl酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，与预期相符。
[0089]
应用引物组合3对待测样品进行pcr扩增；反应同上。酶切反应体系为50.0μl，含pcr产物15.0μl，rcutsmart buffer 5.0μl，dra iii 1.0μl。酶切反应为37℃15min。取10.0μl酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，与预期相符。
[0090]
实施例4对田间样品的检测应用
[0091]
本实施例采用实施例3的方法对田间样品进行检测。草莓灰霉病菌敏感菌株(pd6,qp2,qp5,qp6)，p225f突变菌株(fx1-15,pd1-7,fx1-7,fx1-11)，n230i突变菌株(pd1-3,jd1-2,fx1-1,pd1-1)，h272r抗性突变菌株(js41)，h272y抗性突变菌株(fx35,fx37)均由本研究组从田间采集，相关信息已经发表学术论文，并保存至上海市农业科学院生态环境保护研究所。病原菌dna用植物基因组dna提取试剂盒(货号：dp305，天根生化科技(北京)有限公司)，按操作方法进行提取。
[0092]
应用引物组合1、2、3对待测样品进行pcr扩增；pcr体系均为50.0μl，含1/2体积的2
×
pcr supermix(北京全式金生物)、引物各0.25μmol及dna 10.0ng。pcr程序为：预变性95℃3min；95℃20s、58℃20s及72℃20s，循环30次；最后72℃延伸5min。pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。酶切反应体系为50.0μl，含pcr产物15.0μl，rcutsmart buffer 5.0μl，内切酶1.0μl。酶切反应为37℃15min。取10.0μl酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(图6)。
[0093]
使用本发明的引物、试剂盒和方法对已知突变的样品检测结果与预期结果一致。
[0094]
上述实验结果说明：本发明基于dcaps技术检测灰葡萄孢菌的琥珀酸脱氢酶b亚基点突变类型的引物组合物、试剂盒及方法能有效检测sdh b的7种突变。
[0095]
需要说明的是，本领域技术人员在阅读了本发明上述所讲授的内容之后，可以对上述3组引物序列进行部分碱基的修改，进行pcr扩增和酶切，都可以得到本发明3组引物所取得的效果，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围本领域技术人员在本发明的技术。
[0096]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。