大豆疫霉STT3蛋白及其编码基因与应用

本发明属于生物，具体涉及来自大豆疫霉(phytophthora sojae)的stt3(staurosporine and temperature-sensitive)蛋白psstt3及其编码基因与应用。

背景技术：

1、大豆疫霉为典型的疫霉属植物病原卵菌，其在2015年被molecular plantpathology期刊评选为最重要的10种植物病原卵菌之一。大豆疫霉是引起大豆疫病的病原菌，其为典型的土传植物病原菌，在美国每年由大豆疫霉引起的根腐和茎腐造成数十亿美元经济损失。大豆疫霉可引起大豆种子腐烂、根腐、茎腐以及种苗枯萎，被侵染的大豆植株表现出的典型症状为从根部开始腐烂，由下向上沿着茎干逐渐扩散，在茎部尤其是茎基部形成肉眼可见的褐色病斑。

2、大豆疫霉的生活史分为无性阶段和有性阶段。在有性繁殖阶段，大豆疫霉可以通过同宗配合形成卵孢子。卵孢子壁厚，内含物丰富，能够抵御极端环境，在土壤中存活数年，在适宜条件下，作为初侵染源，可以直接萌发产生菌丝侵染寄主植物。在无性繁殖阶段，大豆疫霉的孢子囊可以直接萌发形成菌丝，也可以分化形成游动孢子，间接进行病害的侵染循环。游动孢子的寿命短，可分化形成休止孢，进而萌发成菌丝或者直接形成二次游动孢子。游动孢子在根部表面形成休止孢，通过萌发菌丝直接侵入或通过伤口、自然孔口侵入根部，以菌丝的方式活体寄生在植物体内并不断扩展，大概15h后其转变为死体营养寄生，在寄主植物表面开始出现坏死斑。

3、综上所述，大豆疫霉菌丝的生长速度、孢子囊和游动孢子的形成是影响病害的发生发展的重要因素。如果减缓大豆疫霉菌丝的生长速率、阻断大豆疫霉孢子囊及游动孢子的形成，降低病原菌侵染寄主植物的能力，则可控制大豆疫霉根腐病的危害。

技术实现思路

1、通过发明人的研究发现，大豆疫霉中的psstt3基因敲除会导致大豆疫霉致死，其具有作为新型杀菌剂分子靶标的潜力。大豆疫霉中的psstt3蛋白与大豆疫霉菌丝的生长速率、孢子囊和游动孢子的产量密切相关，而植物病害正常的侵染循环与菌丝的生长速率、孢子囊产量以及游动孢子产量呈正相关。因此可通过调控stt3蛋白来减慢菌丝的生长、以及阻断正常的孢子囊和/或游动孢子产生，使大豆疫霉侵染寄主的能力减弱，从而控制大豆疫霉根腐病的发生发展。

2、因此，本发明的目的之一是提供一类大豆疫霉stt3蛋白，命名为psstt3，来源于大豆疫霉菌株p6497，是如下a1)或a2)或a3)或a4)：

3、a1)氨基酸序列是如序列2所示的蛋白质；

4、a2)在如序列2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

5、a3)将如序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如序列2所示的蛋白衍生的蛋白质；

6、a4)与如序列2所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

7、为了使a1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上poly-arg(rrrrr)、poly-his(hhhhhh)、flag(dykddddk)、strep-tag ii(wshpqfek)、c-myc(eqkliseedl)等标签。

8、上述a1)-a4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)-a4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。

9、其中，a1)中，序列表中序列2(psstt3)由888个氨基酸残基组成。

10、本发明目的之二是提供编码所述stt3蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。

11、其中，上述stt3蛋白的编码基因为如下b1)或b2)或b3)：

12、b1)序列表中序列1所述的核苷酸序列所示的dna分子；

13、b2)与b1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述stt3蛋白的cdna分子或dna分子；

14、b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述stt3蛋白的cdna分子或dna分子。

15、上述编码基因，序列表中序列1由2756个核苷酸组成；自序列1的5’端第1-270位、第360-2756位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质(psstt3)。

16、所述的rna分子，是所述的编码基因转录得到的rna分子；

17、优选的，所述rna分子的序列为如下c1)或c2)：

18、c1)如序列1所示的dna序列转录的rna序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列1所示的dna序列转录的rna序列相同功能的rna序列；

19、c2)如序列1所示的dna序列转录的rna序列。

20、如本发明的dna序列在严格条件下与如序列1所示dna序列能够进行分子杂交且编码如序列2所示stt3蛋白的dna序列。上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

21、本发明目的之三是提供以上所述核酸分子相关的生物材料，包括重组载体、表达盒、重组微生物或转基因植物细胞系。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。具体的可为如下为下述d1)至d10)中的任一种：

22、d1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；

23、d2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有d1)所述表达盒的重组载体；

24、d3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有d1)所述表达盒的重组微生物、或含有d2)所述重组载体的重组微生物；

25、d4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有d1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

26、d5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有d2)所述表达盒的转基因植物组织；

27、d6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有d2)所述表达盒的转基因植物器官；

28、d7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；

29、d8)含有d7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；

30、d9)抑制上述rna分子翻译的核酸分子；

31、d10)产生d9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

32、本发明目的之五是提供大豆疫霉stt3蛋白及编码stt3蛋白的核酸分子或含有编码stt3蛋白的核酸分子的生物材料的应用。

33、所述应用为下述1)-5)中任一种或几种：

34、1)在调控(提高或降低)大豆疫霉孢子囊和/或游动孢子产量中的应用；

35、2)在调控(提高或降低)大豆疫霉菌丝生长速率中的应用；

36、3)在调控(提高或降低)大豆疫霉侵染寄主能力中的应用；

37、4)在调控(提高或降低)大豆疫霉对寄主的致病性中的应用；

38、5)在抑制和/或杀灭大豆疫霉病菌中的应用；

39、优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制序列1所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的rna分子的翻译，或抑制和/或灭活序列2所述的stt3蛋白的活性来实现1)-5)所述的应用。

40、所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的rna序列的翻译，或抑制和/或失活上述stt3蛋白的活性来调控大豆疫霉孢子囊产量、游动孢子产量、菌丝生长速率和侵染寄主能力，从而能够抑制和/或杀灭大豆疫霉病菌的生长。

41、本发明目的之六是提供所述序列表中序列2所示的stt3蛋白、上述序列表中序列1所示的编码基因在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选大豆疫霉病菌抑菌或杀菌剂中的应用。

42、本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选大豆疫霉抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述大豆疫霉病菌，当所述待检测物能够抑制如上dna序列的转录，或抑制如上rna序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示的stt3蛋白，则所述待测物质为候选的所述植物大豆疫霉抑菌和/或杀菌剂。

43、本发明目的之八是提供一种降低大豆疫霉病菌的活性的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制所述的rna分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的stt3蛋白的活性；

44、其中，所述降低大豆疫霉病菌的活性为降低大豆疫霉病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，和/或者降低大豆疫霉病菌的菌体生长速度，和/或抑制大豆疫霉病菌的孢子囊和游动孢子产量；

45、上述方法中，通过所述抑制或降低待抑制活性或待灭活的蛋白的编码基因表达来实现蛋白的灭活，具体的，可通过基因敲除或通过基因沉默实现。

46、所述基因敲除是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

47、所述基因沉默是指在不损伤原有dna的前提下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活，包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

48、优选的，通过使大豆疫霉中序列表中序列1所示的基因进行基因敲除和沉默，以使所述序列表中序列2所示的蛋白质所示的蛋白质灭活；

49、在本发明的两个实施方式中，使上述基因进行基因敲除的方法是基于crispr/cas9的基因敲除法和基于反义rna的基因沉默法。

50、具体的，基于crispr/cas9的基因敲除法是将目的基因的donor载体和sgrna及cas9共表达质粒转染大豆疫霉筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。

51、所述donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、dodordna序列(可以为nptii或gfp或rfp等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。

52、sgrna及cas9共表达质粒为共同表达靶向待敲除目的基因的sgrna片段和cas9的编码的载体，其中，所述待敲除目的基因为psstt3基因，靶向于psstt3基因的sgrna序列为gaacaggaagtagagaccca。

53、优选的，所述sgrna及cas9共表达质粒是以pyf515载体为出发载体，将psstt3基因的sgrna退火得到的双链sgrna编码序列，插入pyf515载体的nhe i和bsa i酶识别位点之间，得到sgrna及cas9共表达质粒。

54、抑制stt3蛋白质表达和/或活性的物质在制备植物大豆疫霉病菌杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。

55、上述应用中，所述抑制stt3蛋白质表达和/或活性的物质为抑制stt3蛋白质表达和/或抑制stt3蛋白质的编码基因的转录和/或抑制stt3蛋白质的编码基因转录得到的rna分子的翻译的物质。

56、试验证明，本发明所提供的psstt3蛋白在大豆疫霉自身生长发育过程中起作用。利用crispr/cas9基因编辑技术无法获得psstt3基因敲除纯合转化子，psstt3基因敲除会导致大豆疫霉致死。利用cacl2-peg介导的原生质体转化获得的psstt3基因沉默转化子，其生长发育较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：psstt3沉默转化子的菌丝生长速率减慢、孢子囊和游动孢子产量降低，以及侵染寄主植物的能力变弱。因此，大豆疫霉病菌中stt3蛋白在大豆疫霉营养生长、无性生殖及侵染寄主的过程均可发挥重要作用。本发明为大豆疫霉病菌的致病机制研究提供了技术支持，并为未来新型杀菌剂的研发提供了有潜力的分子靶标。