一种选择性KCNQ通道开放剂及其在制药中的应用的制作方法

一种选择性kcnq通道开放剂及其在制药中的应用
技术领域
1.本发明涉及kcnq钾离子通道开放剂，具体地说涉及kcnq2/3钾离子通道选择性调节剂及其在药物制剂中的应用。


背景技术：

2.kcnq钾通道是一类电压门控钾离子通道，其基因编码五种亚型（kcnq1～kcnq5），在心脏、神经元、平滑肌等组织广泛分布。不同亚型的kcnq在组织分布、生理和病理功能上存在差异。kcnq1主要分布于心肌；kcnq2/3主要分布于神经系统；kcnq4和kcnq5在内脏组织中高表达，被认为是内脏疼痛等疾病的药物靶点，kcnq4还分布于内耳毛细胞，该基因的突变可导致遗传性耳聋；kcnq2/3是构成神经细胞m型钾离子通道的分子基础，其基因突变可导致良性家族性新生儿癫痫等一系列神经系统疾病。
3.kcnq2通常和kcnq3以异四聚体的形式编码m通道，激活后产生一种非失活的外向钾电流，称为m电流，kcnq2、kcnq3通道是中枢m电流的分子基础。电压门控非失活型kcnq2/3钾通道特异共表达在神经系统，直接参与控制神经元兴奋性，当神经细胞去极化时，kcnq2/3 通道持续开放可促使膜电位回到静息态，降低神经兴奋，并可调节多巴胺、乙酰胆碱和gaba等多种神经递质释放。对于由神经元过度兴奋引发的神经精神疾病，kcnq2/3通道与癫痫之间的联系得到了广泛研究证实，kcnq2/3通道已经成为了癫痫治疗的明确药物靶点，同时也是神经性疼痛、抑郁及缺血性脑卒中等疾病的潜在治疗靶点。
4.由于靶标确定，kcnq2/3通道开放剂作为抗癫痫创新药物近年来得到了广泛的研究，报道了众多的高活性kcnq2/3通道开放剂，这些化合物绝大多数虽然对kcnq1没有活性，但对kcnq2~5通道亚型没有选择性，从而最严重阻碍了其在药物制剂中的应用。如retigabine（rtg）是迄今为止唯一一个获得欧盟和美国的上市许可的、以kcnq2/3通道开放为靶点的抗癫痫药物。自2011年获批上市后，rtg临床疗效显著，特别是对难治性癫痫及癫痫脑病患者有效。然而，部分患者长期服药后，会出现色素沉着（包括皮肤、指甲、唇部及眼组织，含视网膜），尿潴留等不良反应，严重限制了该品种的临床应用，因此于2017年申请了主动退市。
5.由此可见发现更高活性、选择性更好的kcnq2/3通道开放剂具有重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是提供一种具有更高活性、选择性更好的kcnq2/3通道开放剂，同时提供所述kcnq2/3通道开放剂在制备药物制剂中的应用。
7.本发明的目的通过以下方式得以实现：本发明所提供的选择性kcnq通道开放剂，其化学结构如式a所示：
（a）式a所示化合物（以下简称为化合物a）其化学名称为2-[[6-己基-3-（4-甲基-2-噻唑基）乙基酯-4-氧代-4h-1-苯并吡喃-7-基]氧基]（ethyl 2-[[6-hexyl-3-(4-methyl-2-thiazolyl)-4-oxo-4h-1-benzopyran-7-yl]oxy]），cas登记号为：170466-97-4。化合物a可从商业渠道获得。
[0008]
本发明的有益效果体现在，所提供的化合物a对kcnq2/3通道具有开放高活性及高选择性，而对于kcnq1、kcnq4、kcnq5则不具有开放活性。故其可有效避免现有kcnq2/3通道开放剂在药物制剂应用中的毒副作用。
[0009]
鉴于本发明所提供的化合物a为高活性、高选择性的kcnq2/3通道开放剂，本发明同时提出其在药物制剂中的如下应用：化合物a或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备抗癫痫药物制剂中的应用。
[0010]
化合物a或其药学上可接受的盐或溶剂化物制备镇痛药物制剂中的应用。
[0011]
化合物a或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备抗抑郁症药物中的应用。
[0012]
化合物a或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备治疗缺血性脑卒中疾病药物中的应用。
[0013]
化合物a及其盐可以非溶剂化形式存在，也可以与水、乙醇等药学上可接受溶剂进行溶剂化的形式存在。
[0014]
本发明所述药学上可接受的盐可选择包括但不限于：酸加成盐：如无机酸盐（盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硫酸盐，磷酸盐，硝酸盐等），有机酸盐（甲酸盐，乙酸盐，丙酸盐，三氟乙酸盐，乳酸盐，酒石酸盐，草酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，富马酸盐，苹果酸盐，马来酸盐，苯甲酸盐，柠檬酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，甲苯磺酸盐，羟基乙磺酸盐，葡糖醛酸盐，葡糖酸盐，天冬氨酸盐，谷氨酸盐等）等。
附图说明
[0015]
图1是化合物a对 kcnq2/3开放活性高通量筛选量效曲线图。
[0016]
图2是化合物a对kcnq1/kcne1通道的作用。
[0017]
图3是化合物a对kcnq5通道的作用。
[0018]
图4是化合物a对kcnq4通道的作用。
[0019]
图5是化合物a的膜片钳图（n=5）。
具体实施方式
[0020]
下面通过具体实施例对本发明做进一步阐明。
[0021]
材料和方法1材料1.1主要药品及细胞retigabine(rtg)上海泰坦化学有限公司购得。
[0022]
化合物qo-83由本实验室合成，合成方法见河北医科大学硕士论文，新型kcnq钾通道开放剂的合成、筛选及优选化合物质量标准初步建立，崔富春，2018（化合物2的合成）。
[0023]
化合物a来源于于商业化合物库，也可从陶术生物有限公司购得。
[0024]
kcnq2/3稳转细胞系由北京大学医学部王克威教授惠赠。
[0025]
cho细胞重庆英茂盛业生物科技有限公司购得。
[0026]
kcnq4质粒上海生工生物工程有限公司购得。
[0027]
hek293细胞中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购得。
[0028]
1.2仪器及软件flipr实时荧光监测系统美国moleculardevice公司icr8000离子通道阅读器药明激创（佛山）生物科技有限公司实施例1：化合物a对kcnq2/3通道的作用基于icr8000的kcnq2/3通道开放剂筛选：icr8000在kcnq2/3稳转细胞筛系选：参数设定为：averagecurrent：8ma；entranceslit：0.2nm；peakwl；autogain；integration：10s；delay：0s；autozeroevery；每次进样100μl，标准曲线浓度设置为0ppm、1ppm、2ppm、4ppm、5ppm，相关系数（r值）大于0.998。rtg作为阳性对照品，浓度为1μm、10μm，xe911作为抑制剂对照品，每个浓度设置三个复孔，设置三个空白对照，初筛出的化合物a浓度为3μm和30μm。
[0029]
对初筛出的化合物a进行浓度依赖性（量效曲线）验证，测定化合物a在0.01、0.1、0.3、1、3、10μm浓度下对kcnq2/3通道的开放作用。
[0030]
结果表明，化合物aec
50
=0.77
±
0.65μm，化合物a对kcnq2/3通道具有开放作用，且化合物a活性明显优于阳性对照药rtg（ec
50
值约3.3μm）。详见图1。
[0031]
由此可见，化合物a对kcnq2/3通道具有开放作用。
[0032]
实施例2：化合物a对kcnq1、kcnq5通道的作用将化合物a在kcnq1和kcnq5上验证其对其他kcnq通道活性。kcnq1与kcne1通道共表达于cho细胞，设置浓度为1、10、30μm，qo-83为阳性对照药；kcnq5也表达于cho细胞，设置浓度也为1、10、30μm，rtg为阳性对照药，均采用icr8000筛选技术评价。
[0033]
从图2和图3所示统计结果可以看出化合物a对kcnq1和kcnq5通道均无活性。
[0034]
实施例3：化合物a对kcnq4通道的作用化合物a对kcnq4通道作用评价采用flipr技术。将kcnq4通道瞬转于hek293细胞，flipr参数设置为：excitationled：470-495nm；emissionflilter：515-575nm；cameragate：40%；cameragain：80；exposure：0.3s；ledintensity：60%；additionvolume：50μl；
addition height：70μl；addition speed：100μl/s；tip-up speed：20mm/s。rtg设置为阳性对照药，浓度为1 μm、10 μm，设置三个复孔，三个空白对照，化合物a浓度设置为1μm、10μm，检测其荧光强度。结果见图4，化合物a对kcnq4通道没有开放活性。
[0035]
实施例4：化合物a具有kcnq2/3通道开放活性且存在浓度依赖性化合物a电生理膜片钳验证：膜片钳技术是离子通道研究的金标准，利用全细胞吸破膜片钳记录稳转在cho细胞上的kcnq2/3通道的电流，分别连续给予三个不同浓度的化合物a，再给药10μm阳性药rtg，验证其活性。
[0036]
具体方法为：（1）细胞培养：将细胞悬液铺于圆形盖玻片上，在小皿中培养过夜。
[0037]
（2）配置细胞外液（mm）：nacl 160，kcl 2.5，hepes 10，glucose 8，mgcl
2 1，cacl
2 5，naoh调ph至7.4，4℃保存；细胞内液（mm）：kcl 160，hepes 5，mgcl
2 3，cacl
2 1，koh调ph至7.4，分装，4℃保存。
[0038]
（3）使用全细胞吸破膜片钳，膜片钳放大器采用axon，电极由水平电极拉制仪经多步程序拉制而成，所测得入液电阻值为2～4mω，微电极与细胞膜形成巨阻封接后，在电压钳下开始记录电流。
[0039]
（4）数据处理：原始数据导出用clampfit10.7进行处理，然后用origin进行统计分析，量效关系曲线用logistic公式进行拟合，公式：y=a2+(a1－a2)/[1+(x/x0)
p
]。
[0040]
结果见图5，化合物a具有kcnq2/3通道开放活性且存在浓度依赖性。
[0041]
实施例5：化合物a药物制剂制备鉴于现有研究报道，kcnq2/3通道已经成为了癫痫、神经性疼痛、抑郁及缺血性脑卒中等疾病的潜在治疗靶点。而本发明所述化合物a是具有高活性、高选择性的kcnq2/3通道开放剂，同时其对kcnq1、kcnq4及kcnq5均无活性作用。
[0042]
故化合物a或其药学上可接受的盐或溶剂化物可作为药物活性成分用于制备抗癫痫药物、镇痛药物制剂、抗抑郁症药物以及治疗缺血性脑卒中疾病药物。
[0043]
具体制备方法可采用药物制剂常规技术制备成口服液、片剂、胶囊剂、注射剂、缓释剂等药物制剂。