热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶及其在新型人参皂苷转化中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶及其在新型人参皂苷转化中的应用。

背景技术：

1、人参(panaxginseng meyer)作为一种最重要的传统药物和膳食补充剂，在亚洲使用了数千年，是世界上著名的滋补传统草药。人参皂苷是人参中重要的药理活性成分。从人参属植物中鉴定出159多种天然人参皂苷。根据糖苷配基的结构分为原人参二醇组(ppd)和原人参三醇组(ppt)。ppd和ppt可以通过葡萄糖和其他糖基进一步转化为各种人参皂苷。据报道，不同的人参皂苷具有不同的药理作用。人参皂苷具有多种生物活性，包括增强免疫力、抗癌、抗炎、抗氧化和抗衰老作用。此外，人参皂苷rh2是红参中具有达马烷骨架的一种特征成分，具有多种潜在的生物活性，尤其在抗癌作用中发挥着重要作用。自2006年，人参皂苷rh2被批准为中国的食品补充剂。此外，与人参皂苷的物理和化学转化方法相比，酶法生物转化具有更高的特异性和选择性，且无环境污染。因此，基于其高选择性和高转化率，生物转化被认为是最有前景的方法。

2、糖基转移酶(glycosyltransferases，gts)是自然界中普遍存在的酶，广泛用于低聚糖、多糖、糖缀合物和新型衍生物的合成。udp葡萄糖-甾醇葡糖基转移酶(sgt)是一种典型的参与各种生物体甾醇糖苷生成的酶。gts是一种典型的将活性糖供体转移到各种特定受体分子上的酶。同时它在植物的化合物转化、信号识别和次生代谢过程中起着重要作用，并可改善天然产物的水溶性和吸收能力。甾醇葡萄糖基转移酶(sgt)将糖基部分转移到甾醇和相关化合物中，以在各种生物和药理学活动中产生糖基衍生物和甾基糖苷。sgt属于糖基转移酶家族1，该家族目前描述了90多种gts。相关的糖基转移酶是催化人参皂苷生物合成的最后重要步骤的关键酶。通过糖基转移酶对人参皂苷苷元进行修饰，产生的复杂多样的人参皂苷具有更广泛的药理活性。根据这些药理学研究，不同类型的人参皂苷发挥不同甚至相反药理作用的根本原因在于其不同的糖基化修饰。因此，近年来研究者对人参皂苷苷元的糖基化进行了深入的研究。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶及其在新型人参皂苷转化的应用。本发明通过克隆热带盐水孢菌cnb-440的糖基转移酶基因，并在大肠杆菌中异源表达，获得热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶。进一步利用所述热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶对人参皂苷rh2进行糖基化修饰，制备得到一种新型人参皂苷rh2，该新型人参皂苷rh2具有较强的抑制癌细胞的细胞活力。

2、本发明所采用的技术方案为：

3、一种热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶，其目的基因氨基酸序列如seq idno.2所示，目的基因核苷酸编码序列如seq id no.1所示。

4、所述的热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶的生产纯化方法，包括如下步骤：

5、(1)将热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶的编码基因序列连接到载体上，得到重组表达载体；

6、(2)将步骤(1)所述重组表达载体转化到大肠杆菌中，构建得到重组工程菌；

7、(3)将所述重组工程菌进行培养，诱导蛋白表达后，经离心、纯化，即得所述热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶。

8、步骤(1)中，具体操作为：

9、采用引物对克隆编码所述热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶的目的片段，pcr扩增后进行双酶切，之后将得到的编码热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶的基因序列连接到载体上，即完成重组表达载体的构建。

10、所述引物的序列设计为：

11、sgtf：5′-gct ggatcc ttg atg atg gtg-3'；

12、sgtr：5′-aat ccc gcc ggg cta cgg aagctt agg-3'。

13、步骤(1)中，所述载体为pet32a(+)。

14、步骤(3)的具体操作为：

15、将所述重组工程菌接种到lb-氨苄西林培养基中进行培养后，添加诱导剂进行诱导蛋白表达，冷冻离心后，收集菌体；将菌体重新悬浮在缓冲液中，培养一段时间后，超声处理，并于冰水中冷却，离心去除不溶物，上清液经纯化处理后，得到所述热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶。

16、一种新型人参皂苷rh2的生产方法，包括如下步骤：

17、以原人参二醇为底物、udp-葡萄糖为糖基供体，利用所述热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶对所述原人参二醇进行糖基化，获得的糖基化产物(代谢产物)即为新型人参皂苷rh2。

18、所述糖基化的反应条件为：温度为30-37℃，时间为12-18h，ph为7.5-8.5。

19、所述热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶在金属盐离子和/或铵离子存在下进行催化反应，所述金属离子包括co2+、mg2+、fe3+、na+、cu2+、k+、ca2+、zn2+中的一种或几种。

20、本发明的第一个方面是克隆了热带盐水孢菌cnb-440的sgt基因，并在大肠杆菌bl21(de3)中异源表达。通过使用聚合酶链反应(pcr)和以下引物以粗体显示bamh1和hindiii限制性位点，从基因组dna中扩增靶基因sgt作为模板：sgtf(5′-gct ggatcc ttgatg atg gtg-3')和sgtr(5′-aat ccc gcc ggg cta cgg aagctt agg-3')。用上述引物消化扩增的dna片段，然后插入pgem-t-easy载体中，并检查序列是否存在pcr错误。我们将扩增的基因sgt(含bamhi/hindiii的基因片段)重新克隆到pet32a(+)载体的同一位点以构建重组表达载体-psgt。

21、本发明的第二个方面在代谢物的合成中对温度、ph和金属离子的影响进行了优化。与不含任何金属离子的对照相比，nh4+、ca2+对酶活性有显著刺激。合成的最佳温度为30℃，比其他温度(20℃，37℃，50℃和60℃)更强。sgt的最佳ph值为8，磷酸钠缓冲液为20mm，比其他ph值更有效。

22、本发明的第三个方面是成功制备了一种新的糖苷衍生物。将人参皂苷rh2、udp葡萄糖和添加了nh4+的sgt酶(ph 8，0.1mg/ml)添加到混合物中，并在摇动培养箱中培养。此外，使用溶剂体系chcl3：ch3oh：h2o通过开放式硅胶柱色谱分离和纯化产物，并使用nova-pak c18柱(3.9mm×300mm)通过重复waters prep hplc实现进一步分离和纯化，以进一步表征。

23、本发明的第四个方面是与人参皂苷rh2对ags、b16f10、hela和u87mg细胞的抗癌性能进行了比较，评估了新衍生物和母体衍生物的抗癌性能。使用mtt比色法测定了rh2和12-o-葡萄糖基人参皂苷rh2对6.25μm至200μm排列的b16f10，ags，hela和u87mg的各种癌细胞系进行了测定。细胞活力数据表明，新型化合物12-o-葡萄糖基人参皂苷rh2以剂量依赖性方式降低了四种细胞系的细胞活力。此外，12-o-葡萄糖基人参皂苷rh2在200μm浓度下对四种癌细胞系表现出显着的细胞毒性。

24、本发明的有益效果为：

25、本发明提供的热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶，通过先克隆热带盐水孢菌cnb-440的sgt基因，并在大肠杆菌中异源表达，获得热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶。进一步利用所述热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶对人参皂苷rh2进行糖基化，制备得到一种新型人参皂苷rh2—12-o-葡萄糖基人参皂苷。数据显示：在ags胃癌细胞系、hela宫颈癌细胞系、u87mg胶质瘤细胞系和b16f10黑色素瘤细胞系中测定所述新型人参皂苷rh2的细胞活性，结果表明，12-o-葡萄糖基人参皂苷具有较强的抗癌活性。