一种重组巴斯德毕赤酵母发酵表达生产牛肠激酶（轻链）突变体工艺的制作方法

1.本发明涉及生物技术相关领域，具体为一种重组巴斯德毕赤酵母发酵表达生产牛肠激酶(轻链)突变体工艺。


背景技术：

2.肠激酶是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。分子质量为150ku,由1条115ku重链和1条35ku轻链组成,在ph值4.5～ 9.5、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物，天然的肠激酶来源有限，且提取分离成本高，加之天然提取的肠激酶易被其它蛋白酶污染，造成切割融合蛋白的同时又降解了目的产物，以大肠杆菌为宿主表达的ek多以包涵体的形式存在，需体外复性，操作复杂，且包涵体产物复性后活性蛋白的得率极低。此外，可溶性表达，杂蛋白含量较高，纯化工艺复杂，生产成本较高。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种重组巴斯德毕赤酵母发酵表达生产牛肠激酶 (轻链)突变体工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种重组巴斯德毕赤酵母发酵表达生产牛肠激酶(轻链)突变体工艺，包括发酵、纯化及包装三部分，其具体包括以下步骤：
5.步骤一：对肠激酶菌种进行平板划线培养
6.步骤二：对步骤一培养的种子液进行摇瓶培养
7.使摇瓶放置在摇床内，控制其温度并震荡培养得到一级种子液，使其放置在ypd培养基中培养；
8.其中ypd培养基为1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，ph 6.0；
9.步骤三：对步骤二摇瓶培养的种子液进行发酵罐培养
10.将上述获得的单克隆酵母菌rekl接种于30l bmgy培养基中，控制温度在30℃，转速为250rpm，培养16-18小时，当od
600
达到2-6时,控制转速 3000rpm，离心5分钟，去掉上清；
11.其中，bmgy培养基：1.34％ynb(invitrogen)，4x 10-5％生物素，1％甘油，1％酵母提取物,2％蛋白胨,100mmo1/l nah2po4-na2hpo4，ph 6.0；
12.将上述获得的酵母菌rekl、种子液接种于300l bsm培养基中，转速为 150rpm，25％氨水，控制ph 5.0，温度30℃，通过调节通气量和搅拌转速维持溶氧(do)在20％左右；
13.其中，bsm培养基((g/l))：caso4 0.93,k2so4 18.2,mgso4
·
7h2o 14.9, koh 4.13,甘油30.0,85％磷酸26.7ml/l,ptm 4.35ml/l；
14.ptm溶液(g/l):cuso4
·
5h2o 6,ki 0.08,mnso4
·
h2o 0.2, na2moo3
·
2h2o 0.2,h3bo3 0.02,cocl2 0.5,zncl2 20,feso4
·
7h2o 65,生物素0.2,h2so45.0；
15.步骤四：添加补料
16.当发酵培养基中甘油消耗完全时，do上升，开始补加补料生长培养基，直到达到所
要求的初始诱导菌浓；
17.其中，补料生长培养基：50％(w/v)甘油(5ml/l ptm)；
18.步骤五：对目标蛋白诱导表达
19.当溶氧再次反弹后，饥饿1-2h；添加0.5％浓度的甲醇，开始诱导肠激酶表达，通过甲醇电极测定培养基中甲醇浓度，当重组毕赤酵母适应并且开始消耗初始添加的甲醇表现为do下降时，通过甲醇电极开始进行甲醇流加，并在诱导过程中维持一定的甲醇浓度直到诱导结束。
20.步骤六：离心
21.控制温度在4℃，转速为4000rpm，离心30min并收集发酵液；
22.步骤七：对步骤六离心后的发酵液进行超滤浓缩
23.步骤八：亲和层柱析
24.步骤九：疏水层柱析
25.步骤十：换盐
26.步骤十一：包装
27.将原液蛋白分装于聚丙烯瓶内，冷冻保存。
28.综上所述，本发明有益效果是：
29.1、本发明所开发的重组肠激酶(轻链)采用酵母表达，所得重组肠激酶(轻链)rek纯度高、活性强、性价比优越具有很强的国际市场竞争力，通过在肠激酶(轻链)的n端增加了kr两个氨基酸，提高重组肠激酶rek的分泌表达量；同时将野生型第203位的g突变为s，提高酶的催化效率，通过在肠激酶(轻链)的c端添加组氨酸标签，简化纯化工艺步骤，提高产品纯度。
附图说明
30.为了更清楚地说明发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为本发明一种重组巴斯德毕赤酵母发酵表达生产牛肠激酶(轻链) 突变体工艺发酵工艺流程图；
32.图2为本发明一种重组巴斯德毕赤酵母发酵表达生产牛肠激酶(轻链) 突变体工艺纯化工艺流程图。
具体实施方式
33.本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
34.本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
35.下面结合图1-2对本发明进行详细说明，其中，为叙述方便，现对下文所说的方位
规定如下：下文所说的上下左右前后方向与图1视图方向的前后左右上下的方向一致，图1为本发明装置的正视图，图1所示方向与本发明装置正视方向的前后左右上下方向一致。
36.请参阅图1-2，本发明提供的一种实施例：一种重组巴斯德毕赤酵母发酵表达生产牛肠激酶(轻链)突变体工艺，包括发酵、纯化及包装三部分，其具体包括以下步骤：
37.步骤一：对肠激酶菌种进行平板划线培养
38.步骤二：对步骤一培养的种子液进行摇瓶培养
39.使摇瓶放置在摇床内，控制其温度并震荡培养得到一级种子液，使其放置在ypd培养基中培养；
40.其中ypd培养基为1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，ph 6.0；
41.步骤三：对步骤二摇瓶培养的种子液进行发酵罐培养
42.将上述获得的单克隆酵母菌rekl接种于30l bmgy培养基中，控制温度在30℃，转速为250rpm，培养16-18小时，当od
600
达到2-6时,控制转速 3000rpm，离心5分钟，去掉上清；
43.其中，bmgy培养基：1.34％ynb(invitrogen)，4x 10-5％生物素，1％甘油，1％酵母提取物,2％蛋白胨,100mmo1/l nah2po4-na2hpo4，ph 6.0；
44.将上述获得的酵母菌rekl、种子液接种于300l bsm培养基中，转速为 150rpm，25％氨水，控制ph 5.0，温度30℃，通过调节通气量和搅拌转速维持溶氧(do)在20％左右；
45.其中，bsm培养基((g/l))：caso4 0.93,k2so4 18.2,mgso4
·
7h2o 14.9, koh 4.13,甘油30.0,85％磷酸26.7ml/l,ptm 4.35ml/l；
46.ptm溶液(g/l):cuso4
·
5h2o 6,ki 0.08,mnso4
·
h2o 0.2, na2moo3
·
2h2o 0.2,h3bo3 0.02,cocl2 0.5,zncl2 20,feso4
·
7h2o 65,生物素0.2,h2so45.0；
47.步骤四：添加补料
48.当发酵培养基中甘油消耗完全时，do上升，开始补加补料生长培养基，直到达到所要求的初始诱导菌浓；
49.其中，补料生长培养基：50％(w/v)甘油(5ml/l ptm)；
50.步骤五：对目标蛋白诱导表达
51.当溶氧再次反弹后，饥饿1-2h；添加0.5％浓度的甲醇，开始诱导肠激酶表达，通过甲醇电极测定培养基中甲醇浓度，当重组毕赤酵母适应并且开始消耗初始添加的甲醇表现为do下降时，通过甲醇电极开始进行甲醇流加，并在诱导过程中维持一定的甲醇浓度直到诱导结束。
52.步骤六：离心
53.控制温度在4℃，转速为4000rpm，离心30min并收集发酵液；
54.步骤七：对步骤六离心后的发酵液进行超滤浓缩
55.步骤八：亲和层柱析
56.步骤九：疏水层柱析
57.步骤十：换盐
58.步骤十一：包装
59.将原液蛋白分装于聚丙烯瓶内，冷冻保存。
60.以上所述，仅为发明的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在发明的保护范围之内。因此，发明的保护范围
应该以权利要求书所限定的保护范围为准。