用于检测SMN1基因突变的核酸组合物、试剂盒及方法与流程

用于检测smn1基因突变的核酸组合物、试剂盒及方法
技术领域
1.本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种用于检测smn1基因突变的核酸组合物、试剂盒及方法。


背景技术：

2.脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，sma)是儿童最常见的神经肌肉病，以脊髓前角α-运动神经元退化变性导致的肌无力和肌萎缩为主要临床特征,主要表现为以四肢近端为主的进行性肌无力和肌萎缩。随着疾病进展，可出现呼吸、消化、骨骼等多系统受累。sma患者起病年龄差异性大，从出生前至成人期均可发病，sma发病率约为1/10000。
3.sma为常染色体隐性遗传病。致病基因smn1(omim 600354)定位于5q13.2，转录本编号nm_000344.3(ncbi数据库)，其编码的全长smn蛋白(np_000335.1)在各组织细胞广泛表达，参与剪接体蛋白复合体的组装，是真核细胞生物生存所必需的管家蛋白。smn1双等位基因发生致病性变异通常导致sma发生。sma的致病基因smn1和修饰基因smn2(omim 601627)高度同源，smn1决定疾病的发生，smn2影响疾病的严重程度和进展，使得sma的遗传学诊断不同于绝大多数单基因遗传病。
4.98％的sma患者的smn1双等位基因变异分别遗传自双亲，2％患者有一个等位基因发生新生变异。sma突变基因型主要有两类：95％由smn1双等位基因纯合缺失所致，即[0+0]基因型(smn1缺失大部分为外显子7合并外显子8共同缺失，少部分仅为外显子7缺失)；5％由smn1复合杂合突变所致，即一个等位基因缺失，另一个等位基因发生微小致病性变异，为[0+1d]基因型。smn1发生双等位基因的致病性变异是sma诊断的主要依据，临床诊断或临床疑似sma的患者均应进行基因检测确诊。检测的目标基因为smn1和smn2。其中smn1拷贝数和致病性变异的检测结果用于疾病诊断或排除诊断，smn2拷贝数的检测结果作为患者诊断后的治疗、临床管理和预后评估的参考指标。
[0005]
由于95％的sma患者为smn1外显子7纯合缺失，缺失型突变选择smn1与smn2在外显子7上的差异位点c.840c/t作为检测目标，以区分smn1纯合缺失和非纯合缺失。常规检测缺失型突变的方法包含：多重连接探针扩增(mlpa)、荧光定量pcr、pcr-酶切分析以及ngs等。但mlpa、荧光定量pcr以及ngs方法的成本高、且对检测单位技术和设备要求较高，同时ngs对解读技术人员的生物信息学有较高的要求，并且操作繁琐、耗时长。


技术实现要素：

[0006]
基于此，有必要提供一种能够降低smn1基因突变检测成本的核酸组合物。
[0007]
此外，还提供一种用于检测smn1基因突变试剂盒及方法。
[0008]
一种用于检测smn1基因突变的核酸组合物，所述核酸组合物包括核苷酸序列如seq id no:1所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no:2所示的下游引物。
[0009]
上述用于检测smn1基因突变的核酸组合物，在下游引物序列中将c.842c碱基故意错配为t，对待测模板进行pcr扩增，从而引入了dra i酶切位点。在对扩增产物进行酶切后，
若扩增产物均被切割，则说明待测模板的smn1基因7号外显子纯合缺失。利用该核酸组合物可准确地判断smn1基因7号外显子纯合缺失，且引物经过反复优化，扩增效率高，基本不产生杂带，结果易于判读，降低了诊断成本，节约了诊断时间。
[0010]
在其中一个实施例中，所述上游引物或下游引物有荧光基团标记。
[0011]
在其中一个实施例中，所述荧光基团包括fam、hex、tet、ned、rox、cy5、cy3、texas red、tfam、sybr green i、vic和joe中的任一种。
[0012]
一种检测smn1基因突变的试剂盒，包括如上述任一实施例所述的核酸组合物。
[0013]
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括dntps、dna聚合酶、扩增缓冲液以及水中的一种或多种。
[0014]
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括限制性核酸内切酶draⅰ。
[0015]
上述任一实施例所述的核酸组合物或任一实施例所述的试剂盒在制备检测脊髓性肌肉萎缩症的产品中的应用。
[0016]
一种检测smn1基因突变的非诊断目的方法，包括以下步骤：
[0017]
使用上述任一实施例所述的核酸组合物或上述任一实施例所述的试剂盒，以待测样本的基因组dna为模板进行扩增，得到扩增产物；
[0018]
使用dra i内切酶对所述扩增产物进行酶切，得到酶切产物；及
[0019]
对所述酶切产物进行分析，以判断smn1基因是否突变。
[0020]
在其中一个实施例中，所述方法基于毛细管电泳-pcr。
[0021]
在其中一个实施例中，所述方法用于判断smn1基因7号外显子纯合缺失突变。
附图说明
[0022]
图1为胚胎样本xr1、xr2、xr3和xr4的高通量测序结果图；
[0023]
图2为胚胎样本xr1、xr2、xr3和xr4的毛细管电泳结果图；
[0024]
图3为胚胎样本xr1、xr2、xr3和xr4的page电泳结果图。
具体实施方式
[0025]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0026]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0027]
本技术所述的“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应pcr)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的pcr引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。
guide for the preparation and use of buffers in biological systems，calbiochem，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如tris和hepes制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(pbs)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(tris)缓冲液、tris缓冲盐水溶液(tbs)和tris/edta(te)。
[0040]
在其中一个实施例中，dna聚合酶选自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4 dna聚合酶和klenow片段中的任一种。
[0041]
在其中一个实施例中，上述试剂盒还包含dna提取试剂。
[0042]
具体地，上述dna提取试剂用于执行如下任一种dna提取方法：酚氯仿法、naoh法、树脂提取法、盐析法、十六烷基三甲基溴化胺法、硅胶膜吸附法、fta卡法、硅珠法和磁珠提取法。
[0043]
其中：酚氯仿法通常是指通过酚氯仿混合物萃取dna溶液中的蛋白质类有机物质，保留dna于水相溶液中的dna提取方法。naoh法一般是强碱溶解、变性蛋白质，破坏细胞膜及核膜，变性核酸酶，释放dna，naoh不破坏dna一级结构。树脂提取法常用chelex100法，通过chelex螯合镁、钠和钾等离子，使降解dna的核酸酶失去活性的dna提取方法。盐析法通常是将细胞破碎并离心后，用约6m的饱和nacl沉淀蛋白质，离心上清中dna用无水乙醇沉淀，用te溶解。十六烷基三甲基溴化胺法通常是通过非离子型去污剂ctab破坏细胞壁和细胞膜及硬组织，并与dna形成复合物，分离dna与蛋白质及多糖类物质的dna提取方法。硅胶膜吸附法通常指通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出dna，并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质的dna提取与纯化方法。fta卡法通常指通过fta卡裂解细胞释放dna，从血液、口腔上皮细胞中获得dna的方法。硅珠法通常是指在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，通过二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中dna分子的dna提取方法。磁珠法通常是指在胍盐存在条件下，通过在硅胶外表涂上一层磁性树脂的磁珠，特异性的吸附细胞裂解液裂解后释放出dna的dna提取与纯化方法。
[0044]
在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括限制性核酸内切酶draⅰ。
[0045]
在其中一个实施例中，上述试剂盒用于检测的样本包括血液样本、细胞样本或组织样本。具体地，上述样本包含外周血基因组dna、口腔粘膜细胞dna或口腔粘膜细胞全基因组扩增产物。可以理解的是，上述试剂盒的检测样本不限于上述，还可以是其他组织或细胞的dna，或其全基因组扩增产物。
[0046]
上述任一实施例所述的核酸组合物或任一实施例所述的试剂盒在制备检测脊髓性肌肉萎缩症的产品中的应用。
[0047]
本技术一实施方式还提供了一种检测smn1基因突变的方法，包括步骤a1、步骤a2和步骤a3，具体地：
[0048]
步骤a1：使用上述任一实施例所述的核酸组合物或上述任一实施例所述的试剂盒，以待测样本的基因组dna为模板进行扩增，得到扩增产物。
[0049]
步骤a2：使用dra i内切酶对上述扩增产物进行酶切，得到酶切产物。
[0050]
步骤a3：对上述酶切产物进行分析，以判断smn1基因是否突变。
[0051]
优选地，上述方法基于毛细管电泳-pcr。
[0052]
本技术所述的“毛细管电泳”是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平。
[0053]
在其中一个实施例中，采用abi 3130xl dna测序仪进行毛细管电泳。
[0054]
具体地，基于毛细管电泳-pcr的检测smn1基因突变的方法，通用性强，适用于各种不同类型的样本，可以一次性对大量样品进行分析；且相对于试剂和仪器价格昂贵的高通量测序或mlpa等方法，该方法成本低，易于开展检测。此外，该方法效率高，实验步骤简单，易于操作，单人操作数小时即可完成。最后，该方法结果展示清晰明了，结果易于判断，可以有效避免误诊的情况发生。
[0055]
在其中一个实施例中，上述待测样本包括血液样本、细胞样本或组织样本。
[0056]
在其中一个实施例中，上述方法用于判断smn1基因7号外显子纯合缺失突变。
[0057]
在其中一个实施例中，上述检测smn1基因突变的方法还可以用于非诊断目的。
[0058]
在一些实施例中，上述方法只用于判断待测样本是否存在smn1基因7号外显子纯合缺失突变，不对疾病进行判断。例如，该方法可在构建smn1基因7号外显子纯合缺失突变的细胞模型中用以验证或筛选突变成功的细胞。该方法还可在制备治疗脊肌萎缩症的药物的过程中应用。
[0059]
上述用于检测smn1基因突变的核酸组合物、试剂盒和方法，通过核苷酸序列如seq id no:1所示的上游引物和如seq id no:2所示的下游引物，只进行一次pcr，即可准确地判断smn1基因7号外显子是否存在纯合缺失突变，不需要多重pcr或者高通量测序等繁琐的操作步骤，简单高效，针对smn1基因7号外显子纯合缺失突变的情况的特异性高。
[0060]
具体实施例
[0061]
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
[0062]
实施例1
[0063]
1.收集样本
[0064]
某对夫妻双方为脊肌萎缩症(sma)携带者，smn1基因均存在第7号和第8号外显子杂合缺失突变。该对夫妇经pgt助孕，获得4枚胚胎xr1、xr2、xr3和xr4，胚胎发育至囊胚期进行滋养层细胞活检。
[0065]
2.高通量测序确定胚胎基因型
[0066]
对4枚胚胎的活检细胞分别进行全基因组扩增后，进行高通量测序。高通量测序结果如图1所示。根据图1可知，胚胎xr1和xr4分别遗传父母的致病染色体，为存在smn1基因第7号外显子纯合缺失(患者)；胚胎xr2和xr3遗传了父亲的致病染色体，为smn1基因第7号外显子杂合缺失(携带者)。
[0067]
3.设计引物
[0068]
设计特异性荧光引物，在下游引物序列中将c.842c碱基故意错配为t(见表1中下划线标记的碱基)，其中上游引物的5’端标记荧光基团fam，上游引物和下游引物的核苷酸
序列分别如seq id no:1～2所示(见表1)。
[0069]
表1
[0070]
引物名称序列编号核苷酸序列(5
’‑3’
)上游引物seq id no:1agactatcaacttaatttctgatca下游引物seq id no:2ccttccttctttttgattttgttt
[0071]
4.提取样本dna
[0072]
采用qiaamp dna blood mini kit分别提取四枚囊胚期胚胎xr1、xr2、xr3和xr4的滋养层细胞的基因组dna，具体步骤如下：
[0073]
(1)往1.5ml的ep管中加入20μl的蛋白酶k；
[0074]
(2)加入200μl的全血，混匀；
[0075]
(3)加入200μl的buffer al，颠倒混匀15次，剧烈震荡30秒；
[0076]
(4)简单离心3秒，甩掉管盖和管壁上的液体；
[0077]
(5)56℃水浴10分钟；
[0078]
(6)加入200μl的无水乙醇，颠倒混匀10次，然后剧烈震荡。简单离心3秒，甩掉管盖和管壁上的液体；
[0079]
(7)将吸附柱放入离心管，然后把液体倒入吸附柱中，20000
×
g离心1分钟；
[0080]
(8)弃掉滤液和离心管，将吸附柱放到新的离心管中，加入500μl的buffer aw1，20000
×
g离心1分钟；
[0081]
(9)弃掉滤液和离心管，将吸附柱放到新的离心管中，加入500μl的buffer aw2，20000
×
g离心3分钟；
[0082]
(10)弃掉滤液，换离心管，20000
×
g离心1分钟；
[0083]
(11)弃掉滤液和离心管，将吸附柱放到新的ep管中，加入60μl的洗脱液。室温静置5分钟，13200
×
g离心1分钟，将提取得到的dna洗脱下来。
[0084]
5.pcr扩增
[0085]
按照表2配制pcr反应体系(10μl)，并设置阴性对照(正常样本)、阳性对照(smn1基因7号外显子纯合缺失突变样本)以及空白对照，pcr扩增条件为：95℃预变性90秒，再进行35个循环的94℃变性30秒、56℃退火30秒以及72℃延伸，随后72℃保持5分钟后，4℃维持。按以上pcr扩增条件对样dna进行扩增，得到扩增产物，pcr产物应尽快进行酶切，若不能马上酶切，应暂存于4℃冰箱。
[0086]
表2
[0087]
试剂名称体积(μl)h2o6.310
×
buffer125mm mgcl20.82.5mm dntp1dna taq酶0.2mix引物(上游引物和下游引物)0.2gdna模板0.5
[0088]
6.酶切反应
[0089]
按照表3配制酶切反应体系(10μl)，酶切反应条件为：37℃酶切4小时，65℃20min失活，4℃保持。按以上酶切反应条件对pcr扩增产物进行酶切，得到酶切产物，反应结束后酶切产物应尽快上机进行毛细管电泳。
[0090]
表3
[0091]
试剂名称体积(μl)h2o7.510
×
buffer tango1dra i内切酶(fermentas)1pcr产物0.5
[0092]
7.毛细管电泳
[0093]
将hi-di formamide(高度去离子甲酰胺)与genescan 500 liz dye size standard按100:1的比例混合，加入96孔板中，每孔加入9μl混合液和1μl酶切产物，上机(abi 3130xl dna测序仪)进行毛细管电泳。
[0094]
8.结果分析
[0095]
将毛细管电泳数据拷贝至数据分析电脑，使用genemapper软件进行分析，依据毛细管电泳条带对各样本smn1基因的基因型进行判断，毛细管电泳结果图如图2所示。
[0096]
从图2可看出，样本xr1和xr4的酶切产物进行毛细管电泳，189bp大小的片段完全消失，全部变成165bp大小的片段和24bp大小的片段(后者因分子量太小而未检测出)，说明其基因组存在smn1基因第7号外显子纯合缺失。样本xr2和xr3的酶切产物进行毛细管电泳，提示只有部分189bp大小的片段转变成165bp大小的片段和24bp大小的片段，说明其基因组不存在smn1基因第7号外显子纯合缺失。
[0097]
上述毛细管电泳-pcr的结果提示，样本xr1和xr4存在smn1基因第7号外显子纯合缺失，样本xr2和xr3不存在smn1基因第7号外显子纯合缺失。与步骤2中的高通量测序结果判断一致。
[0098]
实施例2
[0099]
本实施例中步骤1～6与实施例1的步骤1～6相同，还包括以下步骤：
[0100]
7.page电泳
[0101]
对步骤6中得到的酶切产物进行page电泳，电泳完成后进行染色和显色，结果如图3所示。
[0102]
8.结果分析
[0103]
从图3中可看出，样本xr2和xr3的pcr产物经dra i酶切后，只有部分189bp大小的片段转变成165bp大小的片段和24bp大小的片段(后者因分子量太小看不见)，说明其基因组不存在smn1基因第7号外显子纯合缺失。样本xr1和xr4的pcr产物经dra i酶切后，189bp大小的片段完全消失，全部变成165bp大小的片段和24bp大小的片段，说明其基因组存在smn1基因第7号外显子纯合缺失。该结果与步骤2中的高通量测序结果判断一致。
[0104]
从上述实施例可看出，实施例1和实施例2都能准确判断样本基因组dna是否存在smn1基因第7号外显子纯合缺失，说明采用本发明设计的引物能够有效区分待测样本基因组dna是否存在smn1基因第7号外显子纯合缺失。
[0105]
相对于高通量测序，毛细管电泳-pcr和page电泳-pcr的成本更低，不需要复杂的
生物信息学分析方法，效率更高，但又能够准确区分基因突变型。而毛细管电泳-pcr相对于page电泳-pcr，操作更简便，不需要染色和显色等繁杂的步骤，且不会由于染色或显色的问题导致误诊或漏诊，结果展示更加直观，某个片段大小的峰图显示清晰，不存在模糊的情况，此外，通用性也更强，适用于各种不同类型的标本，并且可以一次性对大量样品进行分析。因此，本发明设计的引物结合毛细管电泳-pcr的方法，是优选的检测smn1基因突变的方案。
[0106]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0107]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。