一种利用微生物菌群培养短链脂肪酸的方法与流程

1.本发明属于短链脂肪酸制备领域，特别涉及一种利用微生物菌群培养短链脂肪酸的方法。


背景技术：

2.短链脂肪酸(short-chain fatty acids，scfas)主要由乙酸、丙酸和丁酸组成，在调节宿主代谢、免疫系统和细胞增殖方面具有关键作用，近年来被广泛研究。scfas作为信号分子广泛分布于全身，参与多个系统的病理生理过程，在多种消化系统肿瘤和炎症相关疾病中都强调了scfas的保护机制。亦有研究报道，scfas可以显著改善肠道和肝的氧化应激和炎症反应。因此短链脂肪酸具有良好的应用前景。
3.cn201810125553.8短链脂肪酸及利用污泥厌氧发酵生成短链脂肪酸的方法，利用污泥进行厌氧发酵后期投加甲烷抑制剂并搅拌混合，且在反应器周围施加磁场以生成短链脂肪酸。但是上述生产方法处理流程复杂、设备占地广、生产周期长，且利用污泥作为原料，后期提取短链脂肪酸难度大。cn114032205a公开了一种用于产中链脂肪酸微生物菌群的驯化培养方法，将纤维类废弃物定向生物转化、合成中长链脂肪酸，具有操作简单、成本低、周期短等特点。纤维类废弃物相较于污泥是一种干净能源，但是现有技术中对于利用纤维类废弃物厌氧发酵生产短链脂肪酸的方面涉及较少。
4.基于上述内容，提出一种利用微生物菌群培养短链脂肪酸的方法。


技术实现要素：

5.本发明旨在现有技术存的技术问题，提出了一种利用微生物菌群培养短链脂肪酸的方法。
6.通过以下制备工艺来实现上述目的：
7.本发明提供一种利用微生物菌群培养短链脂肪酸的方法，包括以下步骤：
8.(1)对纤维类废弃物进行预处理；
9.(2)将预处理后的纤维类废弃物与微生物菌群混合置于厌氧产酸培养基中进行厌氧发酵以获得短链脂肪酸。
10.作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤(1)的预处理步骤为：将纤维类废弃物与2％h2so4溶液按比例混合后在100℃反应12h，反应后将纤维类废弃物冲洗至中性，用于厌氧发酵，所述步骤(2)的厌氧发酵时间为4d。
11.作为上述技术方案的进一步改进，，所述步骤(1)的预处理步骤为：将纤维类废弃物与1％naoh溶液按比例混合后在100℃反应12h，反应后将纤维类废弃物冲洗至中性，用于厌氧发酵，所述步骤(2)的厌氧发酵时间为6d。
12.作为上述技术方案的进一步改进，所述比例为液固比10ml/g。
13.作为上述技术方案的进一步改进，所述微生物菌群包括梭状芽胞杆菌clostridia、变形菌gammaproteobacteria和厚壁菌negativicutes。
14.作为上述技术方案的进一步改进，所述微生物菌群的获得方法步骤为：
15.(1)将0.5％/w/v滤纸条置于封闭厌氧环境的富集培养基中，然后将微生物菌群组成菌株接种至富集培养基上在35℃环境中静置富集培养，至滤纸开始分解为一个富集过程，连续重复富集至少3次，获得包含微生物菌群的富集培养液；
16.(2)将所述富集培养液接种于发酵培养基中，加入纤维类废弃物作为碳源，利用滤纸条作为分解外观指标，在35℃环境中静置培养，至滤纸条分解且纤维类废弃物软化时取部分富集培养液作为种子接种到发酵培养基中，继代培养至少10代，筛选分解力强的培养物作为进行厌氧产酸发酵的微生物菌群。
17.作为上述技术方案的进一步改进，所述纤维类废弃物包括玉米秸秆、大豆秸秆、水稻秸秆、木质纤维。
18.作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤(2)中获得短链脂肪酸为乙酸、丙酸、异丁酸和丁酸四种。
19.作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤(2)厌氧发酵起始阶段加入160μl质量浓度为20g/l的碘仿乙醇溶液。
20.本发明的有益效果在于：该方法以纤维类废弃物定向生物转化、合成短链脂肪酸，主要生产乙酸、丙酸、异丁酸和丁酸四种短链脂肪酸，具有操作简单、成本低、周期短等特点，试验效果显著，显示出很好的短链脂肪酸合成效果。
附图说明
21.图1是本发明纤维类废弃物不经过预处理厌氧发酵产生短链脂肪酸的浓度/时间变化图；
22.图2是本发明纤维类废弃物经过酸性处理后厌氧发酵产生短链脂肪酸的浓度/时间变化图；
23.图3是本发明纤维类废弃物经过碱性处理后厌氧发酵产生短链脂肪酸的浓度/时间变化图。
具体实施方式
24.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术做出一些非本质的改进和调整。
25.1、材料
26.本发明所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
27.(1)富集培养基(g/l)：氯化铵(nh4cl)1.0g、磷酸氢二钾(k2hpo4)0.4g、氯化镁(mgcl2)1.0g、酵母膏1.0g，指示剂刃天青和l-半胱氨酸5ml，ph7.0-7.2。
28.(2)厌氧产酸菌培养基(g/l)：nh4cl1.0、mgcl21.0、k2hpo40.4、酵母膏1.0、氯化钠(nacl)1.0、葡萄糖8.0，溴甲酚紫指示剂5ml，ph7.0-7.2。
29.(3)发酵培养基(g/l)：nacl5.0g、nh4cl1.0g、蛋白胨2g、酵母膏提取物1g、碳酸钙
(caco3)2g。
30.2、方法
31.2.1微生物菌群的培养
32.2.1.1富集
33.(1)厌氧瓶或厌氧管预先分装0.5％(w/v)滤纸条，通氮气排空厌氧瓶的氧气；
34.(2)预加900ml蒸馏水于1l的三角瓶中，称取富集培养基组分并依次溶解，调ph至7左右，补水至1l。加热煮沸，直到刃天青的颜色消失，再接着煮沸5min，最后分装到厌氧瓶或厌氧管中，121℃高温湿热灭菌30min；
35.(3)每个厌氧瓶或厌氧管中分装50ml的步骤(2)的富集培养基，将梭状芽胞杆菌clostridia、变形菌gammaproteobacteria和厚壁菌negativicutes接种至富集培养基上，接种量为10％，分别在35℃静置培养。待滤纸开始溃烂时，转接到新鲜的富集培养基中继续富集，连续富集至少3次之后的培养物用于进一步筛选。
36.2.1.2筛选
37.(1)利用2.1.1中步骤(3)的培养物作为富集培养液，将富集培养液接种于50ml培养基中发酵培养基，加入5g的秸秆作为碳源，瓶内放入一片滤纸条作为分解的外观指标，35℃静止培养。
38.(2)当瓶内滤纸条降解，秸秆软化时取2.5ml培养液作为种子接种到同样的新鲜的发酵培养基中，如此分别转接数代后，淘汰分解速率慢的培养物，留下的具有较强分解能力的培养物也继续继代培养，等留下的培养物到10代以上仍然具有较好的分解能力时，选择仍保持高分解能力的培养物作为发酵实验用微生物菌群，微生物菌群中包含梭状芽胞杆菌clostridia、变形菌gammaproteobacteria和厚壁菌negativicutes。
39.2.2秸秆预处理
40.用玉米秸秆为实验材料，烘干粉碎后过30目筛网密封常温保存。
41.玉米秸秆首先预处理，取相同质量的玉米秸秆30g，分别采用2％h2so4溶液和1％naoh溶液预处理方法，各组液固比均为10ml/g，100℃反应时间为12h，预处理后秸秆冲洗至中性，用于厌氧产酸发酵。
42.以未经过处理的玉米秸秆为对照，各种处理方法后的玉米秸秆主要组成如下表所示：
43.表1.不同预处理后的玉米秸秆主要组成
44.项目纤维素/％半纤维素/％木质素/％灰分/％原秸秆40.7225.147.25.691％naoh38.1517.484.013.842％h2so443.343.4412.753.77
45.2.3厌氧产酸发酵试验
46.2.3.1试验步骤
47.(1)采用250ml锥形瓶三组，均置入厌氧产酸菌培养基；
48.(2)分别将2.2中三种不同预处理后的玉米秸秆与微生物菌群混合后置于锥形瓶中，于厌氧培养箱中发酵培养，总固体质量分数为10％，干物质接种率10％，为抑制甲烷的产生，发酵起始阶段添加160μl质量浓度为20g/l的碘仿乙醇溶液作为甲烷抑制剂。
49.2.3.2结果
50.三种不同预处理后的玉米秸秆与微生物菌群混合后厌氧发酵主要生产乙酸、丙酸、异丁酸和丁酸四种短链脂肪酸，具体产量与时间如下表所示：
51.表2.未经过预处理的玉米秸秆厌氧发酵短链脂肪酸浓度变化
52.项目024681012乙酸/ug/ml01.650.910.750.750.730.72丙酸/ug/ml00.310.30.30.30.280.28异丁酸/ug/ml01.031.031.02110.98丁酸/ug/ml01.020.540.450.450.410.41
53.表3.酸处理的玉米秸秆厌氧发酵短链脂肪酸浓度变化
54.项目024681012乙酸/ug/ml01.111.240.960.930.880.87丙酸/ug/ml00.310.310.30.30.270.27异丁酸/ug/ml01.041.021.021.0110.97丁酸/ug/ml01.192.191.821.811.81.78
55.表4.碱处理的玉米秸秆厌氧发酵短链脂肪酸浓度变化
56.项目024681012乙酸/ug/ml01.12.593.142.141.871.82丙酸/ug/ml00.30.330.340.280.310.25异丁酸/ug/ml01.031.041.050.971.020.92丁酸/ug/ml00.62.012.82.42.32.3
57.根据表2-4和图1-3可以清楚看出，玉米秸秆经过酸处理和碱处理后厌氧发酵的短链脂肪酸浓度要比未经过处理的浓度高，其中，在酸处理情况下，在第4天短链脂肪酸产量最高；在碱处理的情况下，在第6天短链脂肪酸产量最高，且乙酸含量远远高于酸处理后厌氧发酵的玉米秸秆的乙酸含量。
58.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。