诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒及应用的制作方法

本技术涉及生物医学，具体而言，涉及诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒及其应用。

背景技术：

1、胰腺癌是起源于胰腺导管上皮及腺泡细胞的恶性肿瘤，其起病隐匿，进展迅速，恶性程度极高，是预后最差的恶性肿瘤之一，胰腺导管腺癌约占胰腺癌的90％以上。近年来，胰腺癌的发病率和死亡率在全球范围内呈上升趋势。由于早期无症状及缺乏有效的诊断方法，胰腺癌在早期很难被诊断出来，绝大多数患者在初次发现癌症时其已发生转移，从而错失最佳的治疗时机。近40年来，胰腺癌的低存活率都没有得到显著的改善。因此，若能够在早期发现胰腺癌，提高手术率，有助于提高患者的生存率和生活质量。

2、目前，胰腺癌的诊断主要依赖于影像学检查，如计算机断层扫描(ct)、磁共振成像(mri)、正电子发射计算机断层扫描(pet)、内镜超声(eus)等。其中，计算机断层扫描(ct)是最常用的对胰腺癌进行诊断和分期的方法，而在内镜超声下对胰腺占位性病变进行穿刺活检，有利于鉴定病变的良恶性。考虑到上述方法或因碘造影剂而具有肾毒性风险，或具有辐射性，或为有创操作，因此，急需便捷的、无辐射性的、高灵敏度、高特异性的、无创的胰腺癌筛查和诊断方法。一些血液肿瘤标志物的诊断方法可以部分满足便捷、无辐射性的、微创的检测的要求，如临床上常用的与胰腺癌诊断相关的肿瘤标志物如ca19-9、cea、ca125等。其中血清标志物ca19-9可用于胰腺癌的辅助诊断、复发监测等，具有一定的临床应用价值。但是，约有10％的胰腺癌患者不表达ca19-9蛋白，而且一些胆道感染或胆道梗阻等患者也会出现ca19-9的升高，因此，利用血液ca19-9的水平诊断或辅助诊断胰腺癌具有较大的局限性，其灵敏度和特异性较低。

3、因此，急需一种灵敏度高的、特异性高的血液标记物用于胰腺癌诊断或辅助诊断。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种灵敏度高和特异性高的诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒，用于诊断胰腺癌，特别是胰腺癌的早期诊断。

2、具体技术方案如下：

3、本技术的第一方面，提供了一种诊断胰腺癌的检测试剂，所述检测试剂包括能够特异性检测受试者样本中目标区域的甲基化水平的试剂，以grch38.p14为参考，所述目标区域包括chr6:30171742～30172465的全长或部分区域。

4、在其中一个实施例中，所述目标区域包括区域1和/或区域2：

5、所述区域1为chr6:30171779-30172465，正链；

6、所述区域2为chr6:30171742-30172444，负链。

7、在其中一个实施例中，所述目标区域包括区域3～区域12中的一个或多个：

8、所述区域3为chr6:30171780-30171930，正链；

9、所述区域4为chr6:30171845-30172007，正链；

10、所述区域5为chr6:30172016-30172123，正链；

11、所述区域6为chr6:30172107-30172226，正链；

12、所述区域7为chr6:30172340-30172463，正链；

13、所述区域8为chr6:30172289-30172444，负链；

14、所述区域9为chr6:30172197-30172309，负链；

15、所述区域10为chr6:30172090-30172190，负链；

16、所述区域11为chr6:30171924-30172044，负链；

17、所述区域12为chr6:30171783-30171879，负链。

18、在其中一个实施例中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区的甲基化水平的检测：

19、甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量pcr法。

20、在其中一个实施例中，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的引物对；或还包括检测目标区域的检测探针。

21、在其中一个实施例中，所述试剂包括检测所述区域1和/或所述区域2的甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对：

22、检测区域1甲基化水平的甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.7和seq idno.8所示，非甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.9和seq id no.10所示；

23、检测区域2甲基化水平的甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.11和seq idno.12所示，非甲基化引物对的核苷酸序列如seq id no.13和seq id no.14所示。

24、在其中一个实施例中，所述试剂包括检测区域3～区域12中的一个或多个区域的甲基化水平的引物对及其对应的检测探针：

25、检测区域3的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.35和seq id no.36所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.37所示；

26、检测区域4的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.38和seq id no.39所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.40所示；

27、检测区域5的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.41和seq id no.42所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.43所示；

28、检测区域6的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.44和seq id no.45所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.46所示；

29、检测区域7的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.47和seq id no.48所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.49所示；

30、检测区域8的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.50和seq id no.51所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.52所示；

31、检测区域9的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.53和seq id no.54所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.55所示；

32、检测区域10的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.56和seq idno.57所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.58所示；

33、检测区域11的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.59和seq idno.60所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.61所示；

34、检测区域12的甲基化水平的引物对的核苷酸序列如seq id no.62和seq idno.63所示，检测探针的核苷酸序列如seq id no.64所示。

35、在其中一个实施例中，所述样本包括血液样本、组织样本或细胞样本。

36、本技术的第二方面，提供了一种诊断胰腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括上述任一项所述的检测试剂。

37、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、核酸纯化试剂、pcr反应试剂、测序试剂、质控品中的至少一种。

38、本技术的第三方面，提供了能够特异性检测受试者样本中目标区域的甲基化水平的试剂在制备胰腺癌的诊断产品中的应用，以grch38.p14为参考，所述目标区域包括chr6:30171742-30172465的全长或部分区域。

39、相对于现有技术，本技术具备如下有益效果：

40、本技术提供用于诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒，对chr6:30171742～30172465的全长或部分区域的甲基化水平进行检测，可用于胰腺癌的诊断或辅助诊断，其检测血液样本的灵敏度范围为73.53％～86.76％，特异性范围为92.05％～97.73％，具有较高的灵敏度和特异性，对于胰腺癌的早期治疗和提高患者生存率具有重要意义。