一种基于丙烯酰化明胶的微凝胶、其制备方法及其应用

1.本发明属于生物材料领域，涉及一种生物相容性微凝胶及其制备方法，特别是通过微流控技术在线光聚合高通量微凝胶的制备，及将其应用于生物活性物质在线包封。


背景技术：

2.生物相容性微凝胶相比于宏观凝胶具有较大的比表面积，凝胶球内物质与环境允许高效的物质交换，且具有一定的可流动注射性。因此在包括生物医学检测、药物及关键生物分子保护和负载，组织修复等领域具有重要的应用价值。在制备生物相容性微凝胶的技术中，液滴微流控技术由于可以大规模生产单分散的微凝胶颗粒，并精确控制其尺寸、成分和结构，因此在尺寸和结构精密性控制方面独具优势，成为微凝胶生产的关键技术，受到广泛关注。液滴微流控技术已广泛应用于多种生物相容性高分子液滴及其微凝胶的制备，主要包括多糖(藻酸盐和琼脂糖)、peg衍生物、明胶、透明质酸和胶原蛋白。
3.在这些材料中，明胶具有许多优势特点：
4.其来源丰富、生物相容性理想、细胞附着的rgd区域丰富、无免疫原性，但其在体温附近或高于体温时所形成的物理凝胶具有不稳定性。因此，人们发展了许多可化学交联的改性明胶。其中，甲基丙烯酰胺化明胶(gelma)是生物制造中应用最广泛的改性明胶，它继承了明胶作为生物相容性凝胶的所有优点，并且可以通过化学或光聚合形成稳定的共价交联凝胶。因此，生产包封生物物质的gelma微凝胶颗粒很有价值。但是现有液滴微流控生产gelma微凝胶颗粒存在两个局限。
5.首先，在室温到体温之间gelma的粘度变化较大，液滴尺寸对温度很敏感，因此需要精确的温度控制才能制备尺寸均匀的液滴。这种需要精密温度控制的制备要求，增加了制造成本，也增加了可能的制造误差。
6.其次，365nm的紫外光源和光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(irgacure 2959)都具有生物毒性，例如蛋白质等生物分子会在紫外光下变性，而细胞即便能在聚合过程中存活下来，也可能改变表型，存在毒副作用。因此只能采用低浓度的irgacure 2959和小剂量的紫外光照射进行微凝胶的光聚合。同时gelma具有缓慢的聚合动力学，这就要求较高浓度的光引发剂和较高的光照剂量才能够形成具有一定力学强度的凝胶微球。这样的制造过程也使在线包封药物、生物活性分子甚至细胞变得困难，需要在高生物相容性和合适的凝胶机械强度之间取得平衡。因此采用一种具有生物相容性、更快反应动力学的明胶衍生物光聚合体系配合微流控在线光聚合芯片是十分必要的。这将有效保护包封物的生物活性，提高整个微凝胶颗粒的生产质量。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术gelma微凝胶的液滴微流体生产存在的粘度变化范围大，紫外光源和irgacure 2959光引发剂毒性高问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种基于丙烯酰化明胶的微凝胶、其制备方法及其应用，本发明能够在液滴微流控装
置中连续、可靠、高通量地在线生产改性明胶微凝胶颗粒。本发明结合液滴微流控高通量、高尺寸均一性的优点，又兼具材料低粘度、高光聚合效率和高生物相容性的优势，能够用于高质量生产生物相容性微凝胶颗粒，制备过程也具有生物相容性，能够满足在线包封活性物质、生物分子和细胞的需求。
8.为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种基于丙烯酰化明胶的微凝胶的制备方法，包括如下步骤：
10.(1)将具有温度敏感性的明胶与具有可供光固化双键的丙烯酸酐结合，形成丙烯酸酐化明胶(gela)；
11.(2)将丙烯酸酐化明胶和可见光光引发剂在溶剂中溶解，得到分散相溶液；以分散相溶液为100％计算，按照质量百分比计量，丙烯酸酐化明胶的加入量为3-20wt.％；搭建恒温装置，并利用液滴微流控方法，使分散相溶液形成均匀的丙烯酸酐化明胶液滴；
12.(3)在收集管道上用可见光在线固化丙烯酸酐化明胶微液滴，制备丙烯酸酐化明胶凝胶微球，作为微凝胶，用于生物活性物质的包覆。
13.优选地，在所述步骤(1)中，丙烯酸酐在明胶上取代氨基的比例为10-99％。
14.优选地，在所述步骤(2)中，所制备的基于丙烯酰化明胶的微凝胶的结构式为：
[0015][0016]
优选地，在所述步骤(2)中，制备分散相溶液时，将丙烯酸酐化明胶和可见光引发剂溶解于纯水、pbs、tbe、细胞培养液中至少一种溶液中，得到分散相溶液；然后利用液滴微流控制备尺寸均匀、可控的丙烯酸酐化明胶液滴。
[0017]
优选地，在所述步骤(2)中，利用液滴微流控方法时，对进入芯片的水相溶液以及形成液滴的芯片温度进行控制，保证凝胶前驱体处于可流动状态。
[0018]
优选地，在所述步骤(2)中，利用液滴微流控方法时，通过调节水相流速以及油相流速，以及芯片结构以及芯片尺寸，可得到不同尺寸的微凝胶，微凝胶尺寸范围在10-1000μm；
[0019]
优选地，在所述步骤(2)中，所使用的光引发剂加入量的质量百分比浓度为0.01-0.5％。
[0020]
优选地，在所述步骤(2)中，利用液滴微流控方法时，所使用的恒温装置控制温度为35-40℃，温度区域覆盖范围从水相入口到形成液滴的芯片位置。
[0021]
优选地，在所述步骤(3)中，通过调节可见光光照距离、光源强度和gela浓度以及光引发剂浓度，形成不同力学强度的凝胶微球。
[0022]
优选地，在所述步骤(3)中，用可见光在线固化丙烯酸酐化明胶微液滴时采用的光源为蓝光。
[0023]
优选地，在所述步骤(3)中，在微流控管道上方放置一个蓝光光源，距离gela微液
滴0.5-3cm，连续光照固化gela微液滴。
[0024]
本发明可见光光源能够将对应的光引发剂引发，一定光强下能够将微液滴实时在线固化，光源温度保持在生物活性物质能够允许的范围内。
[0025]
本发明基于丙烯酰化明胶的微凝胶颗粒，采取了两种策略来提高液滴微流控生产质量和可控性。首先，从材料的角度，采用丙烯酰化明胶(gela)替代传统的gelma，改善其流变性能，同时提高光聚合效率，通过改变光聚合条件或预聚体的性质，可以在很大范围内调节gela微凝胶颗粒的力学性能。其次，可见光光聚合取代传统的紫外光聚合，使其安全性更高，生物相容性更好。将含有丙烯酸酐化明胶和光引发剂的水溶液作为水相，利用液滴微流控技术形成均匀的液滴，在收集管道上用可见光在线固化gela微液滴，制备具有良好生物相容性的gela微凝胶颗粒。将生物活性物质如生物分子或细胞加入含有丙烯酸酐化明胶和光引发剂的水溶液作为水相，采用相同的步骤，可制备包裹有活性物质的gela微凝胶。
[0026]
优选地，一种在线固化gela凝胶微球的方法，具体步骤为：
[0027]
a.将gela与可见光光引发剂溶解在纯水、pbs、tbe、细胞培养液中至少一种溶液中，作为液滴微流控的分散相，以不相容的油作为连续相；所述可见光光引发剂优选采用苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)；不相容的油优选采用hfe 7500、十六烷中至少一种；
[0028]
b.为形成均匀稳定的gela微液滴，将gela温度控制在35-40℃，使其维持在低粘度状态以稳定形成均匀的微液滴；
[0029]
c.在微流控管道上方放置一个与光引发剂配套的可见光光源，连续固化gela微液滴。
[0030]
一种基于丙烯酰化明胶的微凝胶，利用本发明所述的基于丙烯酰化明胶的微凝胶的制备方法制备而成。
[0031]
一种本发明所述的基于丙烯酰化明胶的微凝胶的应用，微凝胶用于生物活性物质的包覆，形成生物活性物质的外层或者保护层，所述的生物活性物质包括细胞以及核酸、蛋白、酶中至少一种生物活性物质。
[0032]
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
[0033]
1.本发明采取两种策略来提高液滴微流控生产高质量凝胶微球的能力，随后可用于生物活性物质的包裹：首先，从材料的角度采取的策略是采用丙烯酸酐修饰明胶，以提供效率更高的改性明胶光固化效率和流动性更好的低粘度特性；其次，从光引发采取的策略是用可见光和可见光引发剂取代紫外光和irgacure 2959引发剂，以实现具有更高安全性、更好的生物相容性、更低成本的制备过程；
[0034]
2.研究结果表明，与甲基丙烯酸酐化明胶(gelma)相比，gela的黏度更低，对温度的依赖性更小，从30℃到40℃，gelma黏度变化率为73.97％，gela的变化率为15.77％，支持生成尺寸更小的微液滴，并提高了液滴尺寸的稳定性；
[0035]
3.本发明在蓝光光源和lap光引发剂作用下，gela的光固化效率高于gelma；通过改变光聚合条件或预聚物的性质，能够有效调节凝胶的力学性能；
[0036]
4.本发明采用液滴微流控装置，实现了连续、可靠和高通量在线生产凝胶微球，且生产过程也具有良好的生物相容性，将生物活性分子或细胞在线包封，能够保留其生物活性。
附图说明
[0037]
图1为gela和gelma黏度随温度变化情况图。其中插图a.不同温度下gela在不同温度下随剪切速率变化；插图b.不同温度下gelma在不同温度下随剪切速率变化；插图c.gela和gelma不同温度下黏度对比。
[0038]
图2为gela和gelma的光固化动力学对比图。其中插图a.gela和插图b.gelma在不同蓝光照射时间下核磁氢谱图。插图c.gela和gelma光固化动力学曲线对比
[0039]
图3为gela和gelma利用微流控制微球尺寸对比图。用液滴微流控在不同流速下制备不同尺寸的gela和gelma液滴。其中插图a.为微观图像和其中插图b.统计数据图。(标尺为100μm)
[0040]
图4为gela和gelma微球在3cm时蓝光固化效果对比图，(标尺为200μm)。
[0041]
图5为gela微凝胶对mcf7和pc12细胞的包封(绿色为活细胞，红色为死细胞)。
[0042]
图6为本发明优选实施例的基于丙烯酰化明胶的凝胶微球的制备方法原理图。
具体实施方式
[0043]
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
[0044]
实施例一
[0045]
在本实施例中，如图6所示，一种基于丙烯酰化明胶的微凝胶的制备方法，步骤如下：
[0046]
采用液滴微流控方法，经蓝光在线固化制备一种基于丙烯酰化明胶的凝胶微球，具体包括如下步骤：
[0047]
首先用超纯水、丙烯酰化明胶和可见光光引发剂lap配制分散相溶液，在分散相溶液中，按照质量百分比计量，丙烯酰化明胶质量百分比浓度为10％，lap质量百分比浓度为0.1％；并采用不溶的氟油作为油相，搭建一个维持温度在40℃的恒温装置，控制水相流速为50μl/h，油相流速为100μl/h，利用液滴微流控技术产生均匀的gela微液滴；
[0048]
在微流控管道上方放置一个蓝光光源，距离gela微液滴1cm，连续光照gela微液滴，实现其固化得到微凝胶，所制备的基于丙烯酰化明胶的微凝胶的结构式为：
[0049]
丙烯酸酐在明胶上取代氨基的比例为10-99％。微凝胶尺寸范围在10-1000μm。
[0050]
实验测试分析：
[0051]
图1为本实施例gela和gelma黏度随温度变化情况图。其中插图a.不同温度下gela在不同温度下随剪切速率变化；插图b.不同温度下gelma在不同温度下随剪切速率变化；插图c.gela和gelma不同温度下黏度对比。由图1可知，图1(a)gela在10℃-20℃的情况下有较高的黏度，在30℃-40℃时黏度急剧下降，且在30℃-40℃其黏度不随剪切速率的变化而变
化，稳定在30毫帕斯卡
·
秒左右。图1(b)对于gelma在10℃-20℃的情况下有较高的黏度，在30℃-40℃时黏度显著下降，同时黏度任然会随着剪切速率的增大而减小。图1(c)将gela和gelma在不同温度下黏度进行对比。发现5℃-25℃两者黏度相差不大，25℃开始gela黏度急剧下降在30℃降至30毫帕斯卡
·
秒，而gelma在30℃时降至900毫帕斯卡
·
秒其黏度是gela的30倍。这意味着相转变温度下gela具有更好地流动性，并且具有更灵敏的温度响应。
[0052]
图2为本实施例gela和gelma的光固化动力学对比图。其中插图a.gela和插图b.gelma在不同蓝光照射时间下核磁氢谱图。插图c.gela和gelma光固化动力学曲线对比图。由图2可知，gela和gelma在1分钟内蓝光聚合动力学分析。图2(a)为gela的蓝光聚合动力学核磁分析，丙烯酸酯双键上的氢在5.75ppm和6.0ppm处有一对特征峰。图2(b)gelma的蓝光聚合动力学核磁分析，甲基丙烯酸酯双键上的氢则在6.1ppm和6.5ppm处。图2(c)根据峰积分面积，推导出gela和gelma的动力学曲线。前15秒两者动力学常数接近，但15秒后，gela动力学常数是gelma的两倍以上。
[0053]
图3为本实施例gela和gelma利用微流控制微球尺寸对比图。用液滴微流控在不同流速下制备不同尺寸的gela和gelma液滴。其中插图a.为微观图像和其中插图b.统计数据图。(标尺为100μm)，由图3可知，图3(a)在相同温度下制备了gela和gelma液滴，油相流速从100μl/h-400μl/h。图3(b)对不同油相流速下两种材料形成液滴尺寸进行统计。100μl/h下gela液滴尺寸为28μm，gelma尺寸为38μm相差10μm，随着油相流速的增加，液滴尺寸逐渐减小。到400μl/h时，gela液滴尺寸达到25μm，gelma为34μm，这表明低黏度gela在液滴微流控所产生的液滴尺寸比gelma小。
[0054]
图4为本实施例gela和gelma微球在3cm时蓝光固化效果对比图，(标尺为200μm)。由图4可知，在相同光照条件下，图4上部分为gela和gelma微凝胶悬浮在油相，下部分为两者除去油相转移到水相溶液中。gela在3cm光照条件下固化形成的凝胶球形貌优于gelma，也再一次证明gela固化效率优于gelma。
[0055]
图5为本实施例gela微凝胶对mcf7和pc12细胞的包封(绿色为活细胞，红色为死细胞)。由图5可知，gela具有良好的生物相容性，存活率在95％以上。
[0056]
研究结果表明，与甲基丙烯酸酐化明胶(gelma)相比，本实施例制备的gela的黏度更低，对温度的依赖性更小，从30℃到40℃，gelma黏度变化率为73.97％，gela的变化率为15.77％，支持生成尺寸更小的微液滴，并提高了液滴尺寸的稳定性；本发明在蓝光光源和lap光引发剂作用下，gela的光固化效率高于gelma；通过改变光聚合条件或预聚物的性质，能够有效调节凝胶的力学性能本实施例方法能够在液滴微流控装置中连续、可靠、高通量地在线生产改性明胶微凝胶颗粒。本发明结合液滴微流控高通量、高尺寸均一性的优点，又兼具材料低粘度、高光聚合效率和高生物相容性的优势，能够用于高质量生产生物相容性微凝胶颗粒，制备过程也具有生物相容性，能够满足在线包封活性物质、生物分子和细胞的需求。
[0057]
实施例二
[0058]
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
[0059]
在本实施例中，一种利用液滴微流控方法并基于丙烯酰化明胶的凝胶微球在线蓝光固化方法，并用其包裹生物活性物质，具体包括如下步骤：
[0060]
先将处于指数生长期的mcf-7细胞消解并用pbs重新悬浮，调节细胞浓度至5
×
106，个/毫升，用pbs溶液、丙烯酰化明胶和可见光光引发剂lap配制分散相溶液，在分散相溶液中，按照质量百分比计量，丙烯酰化明胶质量百分比浓度为10％，lap质量百分比浓度为0.1％；并采用不溶的氟油作为油相，搭建一个维持温度在40℃的恒温装置，控制水相流速为50μl/h，油相流速为100μl/h，利用液滴微流控形成均匀的gela微液滴；
[0061]
在微流控管道上方放置一个蓝光光源，距离gela微液滴2cm，连续光照固化gela微液滴；将固化好的包有mcf-7细胞的gela凝胶洗至细胞培养液中，置于37℃培养箱中培养7天，期间每隔一天换一次培养液，使gela微凝胶包裹生物活性物质。
[0062]
实施例三
[0063]
本实施例与上述实施例基本相同，特别之处在于：
[0064]
在本实施例中，一种利用液滴微流控，并基于丙烯酰化明胶的凝胶微球在线蓝光固化方法，并用其包裹生物活性物质，具体包括如下步骤：
[0065]
先将处于指数生长期的mcf-7细胞消解并用pbs重新悬浮，调节细胞浓度至8
×
106个/毫升，用pbs溶液、丙烯酰化明胶和可见光光引发剂lap配制分散相溶液，在分散相溶液中，按照质量百分比计量，丙烯酰化明胶质量百分比浓度为20％，lap质量百分比浓度为1％；并采用不溶的氟油作为油相，搭建一个维持温度在40℃的恒温装置，控制水相流速为600μl/h，油相流速为1200μl/h，利用液滴微流控形成均匀的gela微液滴；在微流控管道上方放置一个蓝光光源，距离gela微液滴1cm，连续光照固化gela微液滴。
[0066]
实施例四
[0067]
本实施例与上述实施例基本相同，特别之处在于：
[0068]
在本实施例中，一种利用液滴微流控并基于丙烯酰化明胶的凝胶微球在线蓝光固化方法，并用其包裹生物活性物质，具体包括如下步骤：
[0069]
先将蛋白溶解于pbs溶液中，用pbs溶液、丙烯酰化明胶和可见光光引发剂lap配制分散相溶液，在分散相溶液中，按照质量百分比计量，丙烯酰化明胶质量百分比浓度为20％，lap质量百分比浓度为1％；并采用不溶的氟油作为油相，搭建一个维持温度在35℃的恒温装置，水相流速为600μl/h，油相流速为1200μl/h，利用液滴微流控形成均匀的gela微液滴；在微流控管道上方放置一个蓝光光源，距离gela微液滴2cm，连续光照固化gela微液滴。
[0070]
实施例五
[0071]
本实施例与上述实施例基本相同，特别之处在于：
[0072]
在本实施例中，一种利用液滴微流控并基于丙烯酰化明胶的凝胶微球在线蓝光固化方法，并用其包裹生物活性物质，具体包括如下步骤：
[0073]
先将dna溶解于pbs溶液中，用pbs溶液、丙烯酰化明胶和可见光光引发剂lap配制分散相溶液，在分散相溶液中，按照质量百分比计量，丙烯酰化明胶质量百分比浓度为3％，lap质量百分比浓度为0.5％；并采用不溶的氟油作为油相，搭建一个维持温度在35℃的恒温装置，水相流速为100μl/h，油相流速为300μl/h，利用液滴微流控形成均匀的gela微液滴；在微流控管道上方放置一个蓝光光源，距离gela微液滴3cm，连续光照固化gela微液滴。
[0074]
实施例六
[0075]
本实施例与上述实施例基本相同，特别之处在于：
[0076]
在本实施例中，一种利用液滴微流控并基于丙烯酰化明胶的凝胶微球在线蓝光固
化方法，并用其包裹生物活性物质，具体包括如下步骤：
[0077]
先将辣根过氧化物酶(hrp)溶解于pbs溶液中，用pbs溶液、丙烯酰化明胶和可见光光引发剂lap配制分散相溶液，在分散相溶液中，按照质量百分比计量，丙烯酰化明胶质量百分比浓度为3％，lap质量百分比浓度为0.5％；并采用不溶的氟油作为油相，搭建一个维持温度在35℃的恒温装置，水相流速为100μl/h，油相流速为300μl/h，利用液滴微流控形成均匀的gela微液滴；在微流控管道上方放置一个蓝光光源，距离gela微液滴0.5cm，连续光照固化gela微液滴。
[0078]
上述实施例采用微流控技术结合在线光聚合反应，高通量制备一种丙烯酰化明胶微凝胶，及其在生物活性物质包封方面的应用。首先利用液滴微流控技术高通量制备丙烯酰化明胶微液滴，之后在微流控管道上方放置一个与光引发剂配套的可见光光源，实现在线连续生产gela微液滴并固化形成微凝胶颗粒。在线包封物质只需把活性物质与水相预先混合。该技术结合了液滴微流控技术可高通量生产尺寸均一性液滴的优点，又兼具gela低粘度、高光聚合效率和良好生物相容性的优势，能够用于高效率和高质量生产生物相容性微凝胶，制备过程也具有生物相容性，能够满足在线包封生物分子和细胞的需求。
[0079]
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。