一种重组鸭坦布苏病毒E蛋白结构域III蛋白的制备方法

本发明属于兽医生物，具体涉及一种鸭坦布苏病毒edⅲ蛋白的酵母表达及应用。

背景技术：

1、鸭坦布苏病毒，属于黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群。坦布苏病毒最早分离于马来西亚和泰国的伊蚊和库蚊。尽管鸟类及家禽曾经被认为是该病毒的自然脊椎动物宿主，但该病毒所引起的禽类动物疫病的报道却很少，鸭、鹅等水禽如何感染该病尚不得而知，估计与蚊虫有关。同时，有文献报道从鸭场死亡麻雀体内能够检出坦布苏病毒，提示该病毒可以经鸟类传播，也有文献提示从感染鸭泄殖腔能分离到病毒，表明该病毒能经粪便排毒，污染环境、饲料、饮水、器具等，从而造成病毒的散播。

2、e蛋白是鸭坦布苏病毒主要的表面结构蛋白，由500个氨基酸残基组成，包含许多与宿主嗜性、宿主细胞膜融合及宿主细胞表面受体结合相关的抗原表位。根据其功能不同，e蛋白分为三个结构域(i、ii和iii)，而成免疫球蛋白样的第三结构域(ediii)位于病毒最外层，在介导病毒与宿主受体结合中具有重要的作用，同时也是诱导中和抗体的优势表位区域。因此，对ediii的表达和功能研究，对病毒与宿主细胞的相互作用，临床诊断和亚单位疫苗研究具有重要意义。

3、对于新发疫病的诊断和防治工作是科研工作者首要解决的关键问题，建立该病毒的抗体检测方法，对该病的流行病学调查、免疫效果的评价等极有意义，而elisa因具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、易于基层推广等特点而倍受欢迎，成为目前应用最广泛的一种血清学检测方法。因此，本发明以鸭坦布苏病毒ediii基因为模板，通过酵母表达的方法收取到蛋白，再利用纯化的重组ediii蛋白作为抗原建立间接elisa检测方法，为该病毒的早期诊断以及大规模的检测提供技术手段。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鸭坦布苏病毒ediii蛋白的酵母表达方法，通过酵母表达方式收取鸭坦布苏病毒ediii蛋白作为包被抗原，用于坦布苏病毒抗体间接elisa诊断试剂盒中，提高试剂盒的特异性、重复性及稳定性。

2、本发明的另一目的在于提供一种酵母表达的鸭坦布苏病毒ediii蛋白在鸭坦布苏病毒抗体间接elisa诊断试剂盒中的应用。

3、本发明是通过以下技术方案实现的：

4、鸭坦布苏病毒ediii蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示：

5、met gln gly leu lys leu lys gly met thr tyr pro met cys ser asn thrphe ser leu val lys asn pro thr asp thr gly his gly thr val val val glu leuser tyr ala gly thr asp gly pro cys arg val pro ile ser met ser ala asp leuasn asp met thr pro val gly arg leu ile thr val asn pro tyr val ser thr serser thr gly ala lys ile met val glu val glu pro pro phe gly asp ser phe ileleu val gly ser gly lys gly gln ile arg tyr gln trp his arg ser gly ser thrile gly lys ala phe thr ser thr leu lys gly ala his his his his

6、本发明进一步提供了一种重组鸭坦布苏病毒ediii蛋白的制备方法，包括以下步骤：

7、(1)表达载体的构建：人工合成seq id no.1所示的密码子优化的鸭坦布苏病毒edⅲ基因，基因序列上设计有限制性内切酶的酶切位点，将ediii的基因序列和酵母表达载体ppic9k用同样的限制性内切酶酶切后连接在一起，通过双酶切检测和筛选含有ediii基因序列的克隆；

8、(2)酵母表达系统的构建：使用限制性内切酶线性化重组表达质粒，通过电转化的方法，将ediii的基因序列整合到酵母的基因组中得到重组酵母菌株gs115/ppic9k-ediii；将转化后的菌体悬液涂布于md平板上，30℃培养；挑取单菌落，进行筛选鉴定，得到的单菌落进行诱导表达；

9、(3)重组蛋白的纯化。

10、作为本发明的一种优选，所述的制备方法包含以下步骤：

11、(1)表达载体的构建：人工合成的鸭坦布苏病毒ediii基因序列上设计有限制性内切酶的酶切位点，将ediii的基因序列和酵母表达载体ppic9k用同样的限制性内切酶酶切后连接在一起，通过双酶切检测和筛选含有ediii基因序列的克隆。

12、(2)酵母表达系统的构建：使用限制性内切酶线性化重组表达质粒，通过电转化的方法，将ediii的基因序列整合到酵母的基因组中；将转化后的菌体悬液涂布于md平板上，30℃培养；挑取单菌落，进行g418抗性筛选与pcr菌落鉴定，得到的单菌落进行小剂量的诱导表达，sds-page检测表达上清确认阳性克隆。

13、(3)重组蛋白的纯化和活性检测：挑选阳性克隆菌落进行大剂量的诱导表达，表达上清采用protein pure ni-nta树脂纯化，通过sds-page和western blot检测纯化的重组蛋白。

14、作为本发明的一种优选，步骤(2)所述酵母细胞为gs115。

15、作为本发明的一种优选，所述重组酵母菌株gs115/ppic9k-ediii是经过pcr鉴定与g418抗性平板筛选获得的高拷贝的阳性重组酵母。pcr鉴定的通用引物为5′aox1和3′aox1，其序列分别为5′-gactggttccaattgacaagc-3′和5′-gcaaatggcattctgacatcc-3′。

16、作为本发明的一种优选，所述重组酵母为mut+表型的重组酵母。

17、作为本发明的一种优选，所述的重组酵母菌株经发酵培养方法为：将重组酵母菌株gs115/ppic9k-ediii于bmgy培养基中，30℃220rpm培养24小时，离心，弃上清后加入10mlbmmy液体培养基，30℃250rpm培养5天，每隔24小时补充一次甲醇，甲醇浓度维持在1％；或者将重组酵母菌株gs115/ppic9k-ediii于bmgy培养基中，培养至od600为3时，离心收集菌体，转至三角锥瓶，加bmmy培养基稀释至od600为1，以8层无菌纱布封口，30℃220rpm摇床培养96h，每隔24h添加100％甲醇至终浓度为1％。

18、作为本发明的一种优选，利用ni-nta resin柱分离纯化重组鸭坦布苏病毒e蛋白结构域iii蛋白

19、一种用于在酵母中高表达鸭坦布苏病毒edⅲ蛋白的重组酵母表达质粒，所述的重组酵母表达质粒是将人工合成seq id no.1所示的密码子优化的鸭坦布苏病毒edⅲ基因串联入酵母表达载体ppic9k中ecorⅰ和notⅰ两个限制性内切酶位点间所得。

20、一种用于在酵母中高表达鸭坦布苏病毒edⅲ蛋白的重组酵母菌株，所述重组酵母菌株是以酵母细胞gs115为宿主细胞，转染本发明所述的重组酵母表达质粒所得。

21、本发明所述的重组酵母表达质粒、所述的重组酵母菌株在高效表达制备鸭坦布苏病毒edⅲ蛋白中的应用。

22、本发明所述的酵母表达的鸭坦布苏病毒ediii蛋白作为包被抗原在坦布苏病毒抗体间接elisa诊断试剂盒中的应用。

23、一种坦布苏病毒抗体间接elisa诊断试剂盒，其包括用本发明所述方法表达的鸭坦布苏病毒ediii蛋白作为抗原包被的酶标板，100μl鸭坦布苏病毒阳性对照血清，100μl鸭坦布苏病毒阴性对照血清，100μl hrp标记山羊抗鸭二抗，100μl抗体稀释液、100μl显色液、100μl终止液以及洗脱液。

24、上述坦布苏病毒抗体间接elisa诊断试剂盒中，所述hrp标记山羊抗鸭二抗稀释比例为1﹕2000；所述显色液为50mg tmb，10ml dmso，9.8g柠檬酸和1.2ml 30％h2o2加蒸馏水定容至1000ml；所述终止液为双蒸水178.3ml和98％的浓硫酸21.7ml混合。

25、上述坦布苏病毒抗体间接elisa诊断试剂盒中所述酵母表达的鸭坦布苏病毒ediii蛋白包被抗原的包被浓度为4μg/ml。

26、有益效果

27、本发明充分考虑了毕赤酵母的密码子偏好性以及鸭坦布苏病毒ediii二级结构情况，并应用ppic9k载体所携带的抗性g418进行了目的基因高拷贝筛选。通过这些措施，密码子改造后的ediii蛋白表达量大幅提高。

28、其次，本发明使用甲醇诱导表达，以甲醇作为碳源，解决了其他原核表达添加iptg对动物存在毒性问题以及高成本问题。同时，考虑到蛋白纯化困难的缺点，本发明基因工程菌分泌型表达，可以产生具有天然生物活性的真核蛋白产物，无需复性，纯化工艺简单，能够避免蛋白以包涵体形式存在，省去蛋白纯化复性等繁琐步骤。

29、综上，鸭坦布苏病毒ediii基因在酵母中获得了表达，经sds-page和westernblotting试验鉴定具有良好的抗原性，同时具有生产成本较低，纯化方法简单，适合大规模生产等优点。本发明获得的酵母表达鸭坦布苏病毒ediii蛋白作为包被抗原在用于坦布苏病毒抗体间接elisa诊断试剂盒中，能够提高试剂盒的特异性、重复性及稳定性。