一种耐热木糖苷酶突变体及其制备

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1.本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种活力和热稳定性能提升的木糖苷酶突变体及其制备与应用。


背景技术：

2.β-木糖苷酶(β-xylosidase，xyl，ec 3.2.1.37)，是一种外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解聚合度较低的木寡糖(木二糖或木三糖)为木糖。同时β-木糖苷酶还可以作用于萜类、甾体等甙元与木糖形成的糖苷键，释放出甙元。目前，包括xyl在内的木聚糖酶系降解木聚糖，已经被广泛应用于食品、医药、造纸、饲料、能源等多个领域。在食品工业中，β-木糖苷酶可用于烘焙，烘焙使用的面粉中含有2％-3％的阿拉伯木聚糖，将含有β-木糖苷酶的木聚糖降解酶混合物加入到面粉中能够释放滞留在阿拉伯木聚糖中的水分，从而改善面团的可加工性，增加最终产品的体积、改善其面包屑结构，并显著提高面包在消费市场上的保质期；在医药行业，具有转糖基化活性的β-木糖苷酶可以促进木聚糖形成低聚木糖(xos)，xos对人体生理功能有积极影响，如降低胆固醇水平，增加钙的生物利用度，降低结肠癌的风险等；在造纸方面，木聚糖水解酶复合物也用于纸浆和造纸工业中，主要用于在增白之前加工纤维素纸浆。
3.xyl在自然界中广泛存在，目前已经从细菌、放线菌和真菌(包括霉菌、酵母、蕈菌)等微生物和部分高等植物中分离得到。大多数细菌或真菌只生产一种xyl，据报道，α-木糖苷酶只来源于大肠杆菌(escherichia coli)和黑曲霉(aspergillus niger)；β-木糖苷酶的来源较多，主要来源于真菌和细菌，如芽孢杆菌属(bacillus sp.)和梭状芽孢杆菌属(closyridium sp.)等。目前，在11个不同的gh家族中发现了β-木糖苷酶，分别是gh家族1、3、5、30、39、43、51、52、54、116和120，这与木聚糖的异质性相适应，而目前已报道的β-木糖苷酶大部分存在于gh3、gh39和gh43中。
4.定向进化是改善蛋白质功能和活性的重要手段之一，尤其在提高蛋白质热稳定性方面。它属于蛋白质的非理性设计，不需要获得蛋白的高级结构以及催化位点等结构，只需对蛋白氨基酸序列做随机突变。它可以在实验室里模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速得到符合人类应用价值的蛋白突变体。定向进化的核心步骤主要包括构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错pcr、饱和突变、dna改组、交错延伸pcr等。定点突变，即理性设计，在蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等基础上，有的放矢对其进行改造，且只能对天然酶蛋白质中的少数氨基酸进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，对酶功能的改造有限。因此，对于结构与功能未知的酶，定向进化可在一定程度上弥补理性设计的不足。
5.大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白
量甚至能超过细菌总量的30％，因此，大肠杆菌表达系统被广泛应用于基因工程中。
6.酵母表达系统是一种经济高效的真核蛋白表达系统，可以成功实现胞内表达或是分泌表达，且其放大培养基相对廉价，培养条件要求不高，适宜工业放大。酵母表达系统包括酿酒酵母表达系统、甲醇营养型酵母表达系统、裂殖酵母表达系统，因其是真核细胞，所以具有对蛋白质的翻译、加工和修饰过程，此外，酵母表达系统还具有可将异源基因与n-末端前导肽融合、可采用高表达基因的强启动子，并可诱导调控、可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题等优点。随着生物技术的发展，酵母表达系统将会用于更多外源蛋白的表达，更加广泛应用于多个领域。
7.芽孢杆菌表达系统作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。它可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等均可作为表达宿主菌。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究也十分清楚，具有密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、不产生致病毒素、对培养基无特殊要求等优点。随着分子生物学技术的发展和芽孢杆菌研究的深入，使用芽孢杆菌表达系统已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，多种酶和临床需要的化学药品或者工业产品都通过芽孢杆菌来表达生产。


技术实现要素：

8.基于现有技术存在的问题，为了进一步推动β-木糖苷酶在工业领域的应用，需对其现有性质进一步的提升，本发明的目的在于提供一种酶活力和热稳定性能提升的β-木糖苷酶的突变体。
9.实现本发明目的的技术路线概述如下：
10.通过基本的分子生物学技术手段获得克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)野生型xyl编码基因，通过酶切、连接等构建重组载体之后，经测序获得野生型xyl序列(如seq id no.2所示)，利用易错pcr技术对野生型xyl编码基因进行随机突变，利用大肠杆菌表达系统筛选得到xyl突变体s51l，及其编码基因xylm，重新构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌、毕赤酵母菌、枯草芽孢杆菌的高效表达，通过发酵、提取等技术获得酶活力和热稳定性能提高的xyl突变体。
11.本发明提供的技术方案之一，是一种β-木糖苷酶(xyl)突变体s51l，是在seq id no.1所示的野生型xyl的氨基酸序列基础上发生第51位s51l突变获得的；
12.进一步地，所述s51l突变体，具有seq id no.3所示的氨基酸序列。
13.本发明提供的技术方案之二，是s51l突变体的编码基因；
14.进一步地，所述s51l突变体的编码基因，具有seq id no.4所示的核苷酸序列。
15.本发明提供的技术方案之三，是表达上述s51l突变体或其编码基因的重组载体或重组菌株；
16.进一步地，所述重组载体采用的表达质粒为pet-22b、ppic9k或ply-3质粒；
17.进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌bl21(de3)、毕赤酵母菌gs115或者枯草芽孢杆菌wb600。
18.本发明提供的技术方案之四，是上述重组载体或重组菌株的应用，特别是在生产β-木糖苷酶s51l突变体中的应用。
19.本发明提供的技术方案之五，是s51l突变体的应用，特别是在降解低聚木糖制备木糖中的应用，如s51l突变体可以单独或者和木聚糖酶协同作用水解木聚糖生成木糖，或者可从小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、玉米芯和甘蔗渣中碱提木聚糖制备木糖，可以应用于食品行业、医药行业、造纸行业以及能源的制备等多个领域。
20.在本发明中采用如下定义：
21.1.氨基酸和dna核酸序列的命名法
22.使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用单字母或三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。
23.2.xyl突变体的标识
24.采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示xyl突变体中突变的氨基酸。如ser51leu或s51l，表示位置51的氨基酸由野生型xyl的ser替换成leu，位置的编号对应于seq id no.1中野生型xyl的氨基酸序列编号。
25.在本发明中，小写斜体xyl表示野生型xyl的编码基因，小写斜体xylm表示突变体s51l的编码基因，信息如下表。
26.xyl氨基酸突变位点基因突变位点氨基酸seq id no.核苷酸seq id no.野生型——12s51lser51leuagt
→
ctt34
27.本发明的实验方案具体如下：
28.1、酶活力和热稳定性能提升的xyl突变体编码基因的获得，包括如下步骤：
29.(1)以克劳氏芽孢杆菌野生型xyl编码基因xyl(seq id no.2)为模板进行易错pcr随机突变野生型xyl编码基因；
30.(2)将随机突变后的xyl编码基因，通过酶切、连接等构建重组质粒后转入大肠杆菌bl21(de3)中，筛选获得酶活力和热稳定性能提升的xyl突变体，经测序获得xyl突变体编码基因xylm，将含有酶活力和热稳定性能提高的xyl突变体编码基因的质粒pet-22b-xylm保存。
31.2、一株含酶活力和热稳定性能提高的xyl编码基因的大肠杆菌重组菌株及以其制备活力和热稳定性能提高的xyl突变体过程，包括如下步骤：
32.(1)将xyl突变体编码基因xylm与大肠杆菌质粒pet-22b通过连接得到新的重组质粒pet-22b-xylm；
33.(2)将重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)中，经氨苄青霉素钠(amp)抗性筛选，酶切验证得到重组菌株，之后将重组菌株进行培养发酵，得到酶活力和热稳定性能提高的xyl突变体。
34.3、一株含有酶活力和热稳定性能提高的xyl编码基因的毕赤酵母菌菌株及以其制备酶活力和热稳定性能提高的xyl突变体过程，包括如下步骤：
35.(1)将xyl突变体编码基因xylm与质粒ppic9k通过同源重组得到新的重组质粒，先将重组质粒化转到jm109中，经过硫酸卡那霉素(kan)抗性的筛选，挑取阳性克隆子，提取其质粒，用sali单酶切，将重组质粒线性化，再电转转入毕赤酵母感受态细胞gs115中，得到的
重组菌株经过遗传霉素(g418)抗性筛选和xyl的酶活测定，得到酶活力和热稳定性能提高的重组菌株；
36.(2)将重组菌株发酵后，制备酶活力和热稳定性能提高的xyl突变体。
37.4、一株含有酶活力和热稳定性能提高的xyl编码基因的枯草芽孢杆菌菌株及以其制备酶活力和热稳定性能提高的xyl突变体过程，包括如下步骤：
38.(1)将xyl突变体编码基因xylm与穿梭质粒ply-3通过连接得到新的重组质粒ply-3-xylm转入大肠杆菌jm109中，得到的重组菌株经过氯霉素抗性筛选，将阳性克隆子再转入到枯草芽孢杆菌wb600，得到的重组菌株经过kan抗性筛选和xyl的酶活测定，得到酶活力和热稳定性能提高的重组菌株；
39.(2)将重组菌株发酵，制备酶活力和热稳定性能提高的xyl突变体。
40.所述xyl突变体s51l的酶学特性如下：
41.(1)比活：xyl突变体s51l的比活为62u/mg。
42.(2)最适反应温度：50℃。
43.(3)温度稳定性：在ph 8.0条件下，在60℃水浴保温30min后，突变体s51l的残余酶活为86％左右，相比之下野生型已完全失活。
44.有益效果：
45.1、本发明利用易错pcr技术对野生型xyl进行随机突变，得到酶活力提高的突变体s51l。高活力β-木糖苷酶s51l在大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌表达系统内发酵液比酶活最高值分别为62u/mg、26u/mg、32u/mg，较野生型分别提高150％左右。
46.2、本发明利用易错pcr技术对野生型xyl进行随机突变，得到热稳定性提高的突变体s51l，在ph 8.0的磷酸盐缓冲液中，于60℃时保温，发现突变体s51l与野生型xyl相比，随着保温时间的增加稳定性有所提高，保温30min后，突变体xyl残余酶活为86％左右，而野生型xyl已经失活。
47.3、本发明分别使用了大肠杆菌表达系统、毕赤酵母菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统，实现酶活力和热稳定性能提高的s51l突变体不同方式的高效表达。
附图说明：
48.图1为本发明野生型xyl基因的pcr扩增电泳图
49.其中：m为dna marker，1为xyl基因。
50.图2为本发明重组质粒pet-22b-xylm、ply-3-xylm酶切验证图其中：m为dna marker，1为大肠杆菌重组质粒经bamhi和hindiii双酶切电泳图、2为枯草芽孢杆菌中重组质粒ply-3-xylm经bamh i和sam i双酶切电泳图。
51.图3为本发明毕赤酵母阳性转化子pcr验证图
52.其中：m为dna marker，1为毕赤酵母xylm基因电泳图。
53.图4为本发明突变体s51l纯化样品的sds-page图
54.其中：m为dna marker，1为s51l纯化样品。
55.图5为本发明以相对活力为参考的野生型xyl与突变体s51l最适温度曲线其中：wt为本发明野生型xyl，s51l为本发明xyl突变体。
56.图6为本发明以比酶活为参考的野生型xyl与突变体s51l最适温度曲线其中：wt为
本发明野生型xyl，s51l为本发明xyl突变体。
57.图7为对硝基苯酚标准曲线图。
58.图8为热稳定性曲线
59.其中：wt为本发明野生型xyl，s51l为本发明xyl突变体。
具体实施方式：
60.下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
61.1.本发明实施例所用培养基如下：
62.lb培养基(g/l)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，nacl 10.0。
63.10
×
sp盐溶液(g/l)：k2hpo
4 91.7，kh2po
4 30，(nh4)2so
4 10，柠檬酸钠5，mgso4·
7h2o 10。
64.sp i培养基：1
×
sp盐溶液97.6ml，5％酪蛋白水解物400μl，10％酵母汁1ml，50％葡萄糖1ml。(5％酪蛋白水解物：0.5g酸水解酪蛋白溶于10ml ddh2o；10％酵母汁：1g酵母提取物溶于10ml ddh2o；50％葡萄糖：5g葡萄糖溶于10ml ddh2o)。
65.sp ii培养基：sp i培养基99ml，100mm cacl
2 500μl，500mm mgcl
2 500μl。
66.ypd培养基(g/l)：酵母粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。
67.md培养基(g/l)：葡萄糖20.0，琼脂15.0，10％10
×
ynb，0.2％生物素。
68.上述培养基的固态培养基均添加2％琼脂。
69.2.本发明实施例所用的相关溶液如下：
70.lysis buffer：分别量取20ml tris-hcl(1.0mol/l)和120ml nacl(2.5mol/l)溶解在适量水中，用盐酸调节ph值至8.0，然后用ddh2o定容至1000ml，过0.22μm微孔膜抽滤除杂，4℃保存。
71.wash buffer：分别量取20ml tris-hcl(1.0mol/l)、120ml nacl(2.5mol/l)和20ml咪唑(1.0mol/l)溶解在适量水中，用盐酸调节ph值至8.0，然后用ddh2o定容至1000ml，过0.22μm微孔膜抽滤除杂，4℃避光保存。
72.elution buffer：分别量取20ml tris-hcl(1.0mol/l)、120ml nacl(2.5mol/l)和300ml咪唑(1.0mol/l)溶解在适量水中，用盐酸调节ph值至8.0，然后用ddh2o定容至1000ml，过0.22μm微孔膜抽滤除杂，4℃避光保存。
73.本发明中野生型xyl氨基酸序列如seq id no.1所示：
74.mirnpvlkgfnpdpsicrvgddyymavstfewfpgvqihhsrdlvnwrlisrplnrisqlnmignpdsggvwapclsysngkfwlvysdvkvvegntwkdghnylvtcetidgewsepiylnssgfdpslfhdedgrkyvvnmvwdqrvynhrfygiciqeysvlekrlvgkpqmifkgtelglteaphlyqangyyylltaeggtkyehaatiarskeihgpyevhpqnpilsswadprhplqkaghaslvetqhgdwymahllgrpirrrgkklleergfcplgretaiqkiewkddwpyvvngplpsvevagpklpevqwpqdypkcdqfdhpvlnhhyqtlripfnqeigmidheagilrlfgreslhskhtqalvarrwqsfhfdaatevsfypetfqqaaglicyydtenwvslqvtwheqkgrildlvqcdhfhvsqplqgseivvpeqaatvhlkvsvrydtfsfaysfdgshfedigvsfdtyklsddyiahggfftgafvgmhcqdtsgvrkhadfhsfsyhelesnslnqaeggtsarksvihg*
75.本发明中xyl突变体s51l氨基酸序列如seq id no.3所示：
76.mirnpvlkgfnpdpsicrvgddyymavstfewfpgvqihhsrdlvnwrlilrplnrisqlnmignpdsggvwapclsysngkfwlvysdvkvvegntwkdghnylvtcetidgewsepiylnssgfdpslfhdedgrkyvvnmvwdqrvynhrfygiciqeysvlekrlvgkpqmifkgtelglteaphlyqangyyylltaeggtkyehaatiarskeihgpyevhpqnpilsswadprhplqkaghaslvetqhgdwymahllgrpirrrgkklleergfcplgretaiqkiewkddwpyvvngplpsvevagpklpevqwpqdypkcdqfdhpvlnhhyqtlripfnqeigmidheagilrlfgreslhskhtqalvarrwqsfhfdaatevsfypetfqqaaglicyydtenwvslqvtwheqkgrildlvqcdhfhvsqplqgseivvpeqaatvhlkvsvrydtfsfaysfdgshfedigvsfdtyklsddyiahggfftgafvgmhcqdtsgvrkhadfhsfsyhelesnslnqaeggtsarksvihg*
77.以下将通过具体实施例对本发明作进一步解释说明。
78.实施例1：野生型xyl基因xyl的获得
79.1.野生型xyl编码基因来自实验室保存的克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)tccc11004菌株，利用美国omega公司的bacterial dna kit提取基因组。
80.(1)菌株活化：用接种环从甘油管中蘸取克劳氏芽孢杆菌液，接种于lb平板，三区划线，37℃恒温培养12h；
81.(2)转接：从平板上挑取边缘整齐、表面光滑的单菌落接种于5ml液体lb培养基中，220r/min、37℃条件下培养12h；
82.(3)收集菌体：用1.5ml ep管收集上述培养的菌液，12000r/min离心1min，弃上清、收集菌体；
83.(4)加入100μl ddh2o重悬菌体，并加入50μl的50mg/ml溶菌酶，37℃水浴10min；
84.(5)加入100μl btl buffer和20μl蛋白酶k，旋涡振荡；
85.(6)55℃水浴40-50min，每隔20-30min，振荡混匀；
86.(7)加入5μl rna酶，颠倒混匀数次，室温放置5min；
87.(8)12000rpm离心2min，去掉未消化部分，将上清部分转移至新的1.5ml ep管；
88.(9)加入220μl bdl buffer，振荡混匀，65℃水浴10min；
89.(10)加入220μl无水乙醇，吹吸混匀；
90.(11)转移至吸附柱，静置1min，12000rpm离心1min，弃滤液；
91.(12)加入500μl hbc buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；
92.(13)加入700μl dna wash buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；
93.(14)加入500μl dna wash buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；
94.(15)12000rpm，空离2min，55℃金属浴10min，晾干；
95.(16)加入40μl ddh2o洗脱基因组。
96.2.扩增野生型xyl编码基因xyl
97.设计野生型xyl编码基因的扩增引物，序列如下：
98.上游p1(seq id no.5)：
99.cgcggatccgatacgaaaccctgttttaaaagg(划线部分为bamhi酶切位点)
100.下游p2(seq id no.6)：
101.cccaagcttcccatgaatcacacttttccta(划线部分为hindiii酶切位点)
102.pcr扩增的反应体系为50μl，其组成为：
103.primestar max25μl
上游引物p1(20μmol/l)2μl下游引物p2(20μmol/l)2μl基因组2μlddh2o19μl总体积50μl
104.注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司takara。
105.扩增程序的设置为：
106.a.预变性:98℃7min；
107.b.变性：98℃10s；
108.c.退火：57℃15s；
109.d.延伸：72℃20s；
110.e.b-d反应30个循环；
111.f.延伸：72℃10min。
112.将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到克劳氏芽孢杆菌野生型xyl编码基因xyl的条带，约1600bp(见图1)，再由dna切胶回收试剂盒回收pcr产物，通过酶切、连接pet-22b，构建重组质粒pet-22b-xyl，送测序公司进行测序，获得野生型xyl基因序列(seq id no.2所示)。
113.实施例2：xyl突变体s51l的获得
114.1.易错pcr：以野生型xyl编码基因xyl为模板进行易错pcr，其反应体系如下：
115.ddh2o21μl重组质粒pet-22b-xyl(5ng/μl)1μl上游引物p1(10μmol/l)2μl下游引物p2(10μmol/l)2μltaq dna聚合酶0.5ml10
×
taq buffer5μldatp(10mmol/l)1μldgtp(10mmol/l)1μldttp(10mmol/l)5μldctp(10mmol/l)5μlmgcl2(25mmol/l)10μlmncl2(10mmol/l)1.25μl
116.注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司takara。
117.体系完成后，进行易错pcr反应，程序设置如下：
118.a.预变性:94℃5min；
119.b.变性：94℃30s；
120.c.退火：56℃30s；
121.d.延伸：72℃120s；
122.e.b-d反应30个循环；
123.f.延伸:72℃5min。
124.pcr反应结束后，将pcr产物与载体质粒进行bamh i和hind iii双酶切，经过纯化回收，易错pcr产物与同样经过双酶切的载体质粒pet-22b进行连接，通过转化大肠杆菌bl21(de3)，涂布于含amp(100μg/ml)的lb固体培养基，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子。
125.3.筛选方法：采用对硝基苯酚比色法(p-npx法)测定β-木糖苷酶的酶活性。在一定条件下，β-木糖苷酶能够将对硝基苯基-β-d-木糖苷(p-npx)中的糖苷键进行水解，生成对硝基苯酚(即p-np)，对硝基苯酚在碱性的条件下呈现黄色，利用酶标仪测定其405nm处吸光度，计算对应对硝基苯酚含量，进而算出β-木糖苷酶的酶活力。
126.4.突变体文库的筛选：在48孔板中每个孔加入720μl含amp(100μg/ml)的lb液体培养基，随后，用灭过菌的小枪头挑取每一个转化子的单克隆至48孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将48孔板转移至摇床培养，440rpm，37℃培养6h。然后转接至每孔加入5ml含amp(100μg/ml)的lb液体培养基中，摇床培养，400rpm，37℃培养6h，最后，加入3μl 1mol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，180rpm，16℃诱导16h。采用低温离心机(4采)，5000rpm离心10min，弃上清，用ph＝7.0的磷酸钠缓冲液(210μl)重悬菌液，随后加入30μl溶菌酶(50mg/ml)破碎菌体，采用孔板离心机，5000rpm离心10min，获得上清酶液，取20μl酶液加入到100μl反应液的96孔板1中，60液反应10min，然后取100μl反应液加入100μl的反应终止液，检测405nm处的吸光值。将剩余上清酶液放置在60在保温10min，随后用孔板离心机5000rpm离心1min，采用相同的方法在60用下检测96孔板2的酶活力。
127.注：反应液：60μl的对硝基苯基-β-d-吡喃木糖苷(1mg/ml)和40μlph＝8.0的磷酸钠缓冲液；反应终止液：100μl的0.4mol/l的na2co3溶液。
128.5.选取酶活力和热稳定性提高的突变体。根据板1与板2的情况，计算每个突变体的酶活，选取相较于野生型酶活和热稳定性能均获得提升的突变体，对选取的突变体进行酶活与热稳定性能的重复实验后，获得在60℃保温10min后酶活下降量较野生型少的突变体，将该突变体重组菌接入平板，挑取转化子，提质粒、酶切验证(如图2中1泳道所示)，并进行测序。
129.经过上述步骤的易错pcr，选取出活力和热稳定性能提高的突变体的大肠杆菌重组菌株bl21(de3)/pet-22b-xylm，测序后得到其中含有一个位点的氨基酸突变，即s51l(agt
→
ctt)，从而获得xyl突变体s51l(seq id no.3)，及其编码基因xylm(seq id no.4)。
130.实施例3：构建毕氏酵母菌酶活力和热稳定性能提升的xyl表达重组菌株
131.1.构建酶活性和热稳定性提升的xyl表达质粒ppic9k-xylm
132.将毕赤酵母表达载体ppic9k经ecori和noti双酶切后和s51l突变体编码基因xylm连接，构建得到重组质粒ppic9k-xylm，转化至大肠杆菌jm109感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行pcr验证并测序，确定构建成功，即获得重组表达质粒ppic9k-xylm。
133.2.表达质粒ppic9k-xylm转化毕赤酵母gs115
134.构建的重组质粒在电转化毕赤酵母前，需要对质粒ppic9k-xylm进行线性化处理，来提高重组质粒在毕赤酵母染色体上整合的效率。用sali对ppic9k-xylm进行单酶切，纯化回收获得线性化质粒dna。
135.(1)制备毕赤酵母菌gs115感受态
136.①
菌种活化，用接种环将毕赤酵母gs115接种于ypd固体培养基，30℃培养48h；
137.②
挑单菌落接种于ypd试管中，30℃，200rpm，培养12h；
138.③
以2％的接种量，将种子液接种于50ml新鲜的ypd培养基中，30℃，培养4-5h至od
600
达到1.4左右；
139.④
用低温离心机(4℃)，5000rpm，离心8min，弃上清；
140.⑤
菌体用30ml预冷的无菌蒸馏水洗涤，放置冰上5-10min，用低温离心机(4℃)，5000rpm，离心8min，弃上清；
141.⑥
重复步骤
⑤
；
142.⑦
菌体用15ml1 mol/l预冷的山梨醇重悬混匀，并放在冰上静置5min，用低温离心机(4℃)，5000rpm，离心8min，弃上清；
143.⑧
用800μl缓冲液重悬菌体(1mol/l山梨醇，15％甘油)；
144.⑨
分装感受态，每管80-100μl，-80℃保存备用。
145.(2)电转毕赤酵母菌
146.①
提前打开电转仪对其预热；
147.②
将10μl重组质粒ppic9k-xylm和100μl感受态混匀后转移至0.2cm电转杯中，冰浴10min；
148.③
1500v，电击5ms后，立即加入1ml 1mol/l山梨醇，将电转后的菌悬液从电转杯中洗出，转移至1.5ml的预冷无菌ep管中，30℃，220rpm复苏1-2h，涂布于筛选平板md平板，30℃培养60h以上。
149.3.毕赤酵母高拷贝转化子的筛选
150.(1)对md平板上的所有转化子，用已灭菌的牙签将转化子全部点接在含终浓度为0.5mg/ml g418的ypd固体平板上；
151.(2)选取终浓度是0.5mg/ml g418的ypd固体平板中的单菌落(菌落直径较大)，用已灭菌的牙签点接在含有终浓度是2mg/ml g418的ypd固体平板上。
152.(3)挑取终浓度是2mg/ml g418的ypd固体平板上的单菌落(菌落直径较大)，提取酵母菌的基因组对其进行pcr验证。
153.4.毕赤酵母高拷贝转化子的鉴定
154.毕赤酵母基因组的提取：
155.(1)离心收集过夜培养后的酵母菌细胞，向其中加入300μl基因组裂解液，用移液器反复吹吸使菌体悬浮；
156.(2)加入一定量的石英砂并在振荡器上震荡25min，使酵母细胞壁充分破碎；
157.(3)再加400μl的基因组裂解液，12000r/min离心10min；
158.(4)将所得上清液转移至另一ep管，加入等体积tris饱和酚/氯仿(1:1)的混合液，充分混匀后，12000r/min离心15min，并将上清液转移至另一ep管中；
159.(5)经2次反复抽提后，用等体积的氯仿抽提1次，以去除残留的苯酚；
160.(6)12000r/min、离心15min后将上清液转移至另一ep管并向其中加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒几次后在-80℃放置20min，12000r/min离心8min来回收基因组dna沉淀；
161.(7)以70％的乙醇来洗涤沉淀2～3次；
162.(8)将ep管在空气中干燥20-30min，让其没有酒精味后加入40μl的无菌水以溶解
沉淀。
163.阳性转化子的pcr验证：以基因组dna作为模板进行了pcr扩增反应，pcr反应条件参照实施例1，pcr验证正确(如图3中1泳道所示)，得到毕赤酵母重组菌株gs115/ppic9k-xylm。
164.实施例4：构建枯草芽孢杆菌酶活力和热稳定性能提高的xyl表达重组菌
165.1.构建热稳定性能提升的xyl表达质粒ply-3-xylm
166.将s51l突变体基因xylm与枯草芽孢杆菌表达载体ply-3都经bamhi和smai双酶切，随后进行连接，构建得到重组质粒ply-3-xylm，转化至大肠杆菌jm109感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证并测序，确定构建成功，即获得重组表达质粒ply-3-xylm。
167.2.表达质粒ply-3-xylm转化枯草芽孢杆菌wb600
168.(1)枯草芽孢杆菌wb600菌种活化，在无抗lb平板上三区划线，培养12h；
169.(2)挑取单菌落，接种于含有5ml lb培养基的试管中，37℃，220rpm培养12h；
170.(3)按2％的接种量，取100μl种子液接种于含有5ml spi培养基的试管中，37℃，220rpm，培养3-4h至od
600
＝1.2；
171.(4)快速取200μl接种于2ml spii培养基，37℃，100rpm，培养1.5h；
172.(5)加入20μl的10mm egta，37℃，100rpm，培养10min；
173.(6)加入1-2μl重组质粒，37℃，100rpm，培养30min后，转速调至220rpm，继续培养1-2h；
174.(7)将菌液转移至已灭菌的1.5ml ep管中，5000rpm离心5min，弃上清，留50μl培养液重悬菌体，菌液涂布于含kan的平板；
175.(8)挑转化子，提质粒、酶切验证(如图2中2泳道所示)，得到枯草芽孢杆菌重组菌株wb600/ply-3-xylm。
176.实施例5：活性和热稳定性能提升的xyl在大肠杆菌重组菌中的表达及制备
177.1.将大肠杆菌重组菌株bl21(de3)/pet-22b-xylm接种于含氨苄抗性(100μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，220r/min，培养2h，菌液od
600
＝0.6，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，16℃、120rpm/min诱导培养16h。
178.2.菌体破碎：用500ml离心杯收集发酵液，8000rpm/min离心15min，弃发酵上清，然后加入适量lysis buffer(每250ml发酵液收集得到的菌体加入20ml lysis buffer)将菌体重悬混匀，对菌体进行超声破碎。破碎结束后，用50ml离心管收集溶液，12000rpm离心30min得到可溶性蛋白上清。
179.3.树脂预处理及蛋白与树脂的结合：在离心的同时，向纯化柱中加入两个柱体积的lysis buffer清洗ni
2+
树脂中残留的乙醇，从而平衡ni
2+
树脂。在完成离心后将破碎上清加入到含有ni
2+
树脂的容器中，利用小型转子在100rpm的磁力搅拌器上反应结合1-2h，同时全程保持低温(0-4℃)，以免使酶活力受损。结合完成后将结合液转移至重力柱中。
180.4.蛋白纯化
181.(1)将结合后的溶液分批加入到重力柱中，使溶液全部滤过重力柱，并用滤过液清洗反应容器内壁，再次将含有树脂的滤过液转移到重力柱中，尽可能地实现所有树脂的回收；
182.(2)待结合后的溶液完全流出后，向纯化柱中加入提前预冷的5ml lysis buffer，用来清洗没有与树脂结合或者结合力较弱的杂蛋白；
183.(3)待lysis buffer流尽，分六次加入预冷的60ml wash buffer，对结合到树脂上的杂蛋白进行洗脱；
184.(4)最后用预冷的含500mmol/l咪唑的5ml elution buffer洗脱树脂，重复一遍，收集此时缓慢流出柱子的滤液至30,000kda的超滤管中，目标蛋白即在此溶液中；
185.(5)置换缓冲液：由于此时的目标蛋白溶液由含500mmol/l咪唑的elution buffer洗脱，溶液中存在的大量咪唑可能会对后续实验造成影响，从而需要置换缓冲液。用2500
×
g的离心力离心至管内溶液在1ml左右时，补加9ml的磷酸钠缓冲液(ph 8.0)，重复置换两次，便完成了缓冲液为elution buffer向磷酸钠缓冲液的置换。最后将得到的酶液转移到新的ep管中低温(4℃)保存，即获得了s51l突变体的纯酶液(sds-page见图4)。
186.实施例6：活力和热稳定性能提升的xyl在毕赤酵母菌中的表达及制备
187.1.平板三区划线活化重组菌株gs115/ppic9k-xylm；
188.2.ypd种子液培养：挑取单菌落接种于5ml含kan的抗性ypd培养基中，30℃、200r/min振荡培养24h；
189.3.bmgy菌体富集培养：以2％的接种量转接于含有bmgy培养基中，于30℃、200r/min发酵培养16h。
190.4.bmmy诱导培养：bmgy菌体离心(4℃，5000r/min，8min)；加入bmmy(15ml)重悬、离心，重复两次，最终菌体重悬加入bmmy培养基中，6天，每隔12h各加250μl甲醇诱导同时每隔24h加100μl kan抗性；
191.5.收集发酵上清，即获得s51l的粗酶液，测定酶活。
192.实施例7：活力和热稳定性能提升的xyl在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备
193.1.将枯草芽孢杆菌重组菌株wb600/ply-3-xylm接种于含卡纳霉素(50μg/ml)的5ml lb液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；
194.2.按2％接种量转接于50ml的lb培养基中，37℃，220r/min培养48h，离心收集发酵上清，即得到热稳定性能提升的s51l粗酶液，测定酶活。
195.实施例8：s51l酶活力和热稳定性能测定
196.1.s51l酶活测定原理
197.β-木糖苷酶能够将对硝基苯基-β-d-木糖苷(p-npx)中的糖苷键进行水解，生成对硝基苯酚(即p-np)，对硝基苯酚在碱性的条件下呈现黄色，利用酶标仪测定其405nm处吸光度，计算对应对硝基苯酚含量，进而算出β-木糖苷酶的酶活力。
198.2.标准曲线
199.精确称取0.0139g对硝基苯酚用ddh2o溶解并定容到100ml配制成1mmol/l的对硝基苯酚标准溶液，用ddh2o将上述标准溶液分别稀释为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mmol/l，以水为空白对照，取上述稀释好的标准对硝基苯酚溶液和水对照于96孔板中，随后加入100μl 0.4mol/l的na2co3溶液进行显色反应，测定所有标准样品及对照样品在405nm处的吸光值。以吸光值为纵坐标(y)，对硝基苯酚的浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线(如图7所示，y＝2.28173x+0.10514，r2＝0.994)。
200.3.酶活定义
201.β-木糖苷酶活力单位(u)定义为：在一定温度和ph条件下(如未特别说明，则ph为8.0，温度为60℃)，以对硝基苯基-β-d-木糖苷(p-npx)为底物，每分钟释放出1μmol对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶活力单位。
202.酶活力：
203.式中：u代表酶活力单位；
204.v代表最终测酶活体系的总体积(μl)；
[0205]v0
代表所取酶液体积(μl)；
[0206]v1
代表总反应液的体积(μl)；
[0207]v2
代表所取反应液的体积(μl)；
[0208]
c代表p-np的浓度(mmol/l)；
[0209]
t代表反应时间(min)；
[0210]
n酶液的稀释倍数。
[0211]
4.xyl酶活测定方法与步骤
[0212]
将反应体系：60μl反应液于60℃保温1min，加入60μl酶液(v0)，总反应体积为120μl(v1)，ph＝8.0条件下60℃反应10min，吸出100μl反应液(v2)加入100μl反应终止液中终止反应，以上为最终测酶活体系的总体积200μl(v)；采用酶标仪在405nm检测od值。样品均含有3组平行实验。
[0213]
注：反应液：60μl的对硝基苯基-β-d-吡喃木糖苷(1mg/ml)；
[0214]
反应终止液：100μl的0.4mol/l的na2co3溶液。
[0215]
5.酶活测定结果如下表(分别以实施例5制备的纯酶液、实施例6和7制备的s51l粗酶液，以及同样方法制备的野生型xyl粗酶液为实验对象)：
[0216][0217]
注：野生型xyl纯酶液或粗酶液的制备中，首先采用实施例2、3、4同样的方法构建野生酶重组菌株，之后采用实施例5、6、7同样的发酵方法制备野生酶粗酶液。
[0218]
比酶活＝酶活力(u/ml)/粗酶液蛋白浓度(mg/ml)。
[0219]
6.最适温度
[0220]
将野生型(wt)与突变体(s51l)的酶液(所用酶液为实施例5获得，野生型也采用同样方式制备)在ph为8.0条件下，分别于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100野进行酶活测定，以最高活力作为100％，计算其在各个温度下的比活力和相对活力，结果如图5和图6所示，野生型最适温度为60℃，突变型最适温度为50℃。
[0221]
7.热稳定性能的检测
[0222]
通过记录野生型(wt)与突变体(s51l)在不同温度下，保温一定时间的残余酶活变化，以体现xyl的热稳定性能的变化。
[0223]
将野生型(wt)与突变体(s51l)的酶液(所用酶液实施例5获得，野生型也采用同样方式制备)，在60℃下分别保温10、20、30、40、50、60min，每个时间点测一次残余酶活力。测定方法按步骤4进行。以未经过处理时的酶活为100％，计算处理后的残余酶活力，结果如图8所示。
[0224]
本实验记录发现，在60℃时，保温30min，野生型的基本失活，s51l突变体的残余酶活为85.7％左右。
[0225]
通过以上对比发现，s51l突变体的酶活力和热稳定性相较于野生型xyl均有提高。
[0226]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。