一种利用甲醇为碳源的苏云金芽孢杆菌及其应用

1.本发明涉及一种利用甲醇为碳源的苏云金芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)作为革兰氏阳性微生物，其在害虫防治中发挥了巨大的作用，是近年来研究最深入、开发最迅速、应用最广泛的微生物杀虫剂。苏云金芽孢杆菌的防虫原理是其菌株可产生内毒素(伴胞晶体)和外毒素两类毒素，使害虫停止取食，害虫均因饥饿、血液败坏和神经中毒而死，在农业上被广泛用作生物农药。此外，作为通常认为安全的微生物，其生长速度快，在合成生物学领域的应用具有巨大潜力，适合作为蛋白表达和代谢工程的宿主。甲醇作为微生物的潜在可再生碳源具有诸多优势，如价格低廉、易于获得和环保。但是，目前尚开发出可利用甲醇为碳源的苏云金芽孢杆菌。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明提供一种可利用甲醇为碳源的苏云金芽孢杆菌，并通过代谢工程手段使其提升对甲醇的利用效率。
4.本发明的第一个目的是提供一种利用甲醇为碳源的苏云金芽孢杆菌，所述的苏云金芽孢杆菌在宿主中异源表达甲醇脱氢酶mdh、mdh激活蛋白act、3-己酮糖-6-磷酸合酶hps、6-磷酸-3-己酮异构酶phi和nadh脱氢酶ndh。
5.进一步地，所述的甲醇脱氢酶mdh的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述的mdh激活蛋白act的氨基酸序列如seq id no.2所述。
6.进一步地，所述的3-己酮糖-6-磷酸合酶hps的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述的6-磷酸-3-己酮异构酶phi的氨基酸序列如seq id no.4所示。
7.进一步地，所述的nadh脱氢酶ndh的氨基酸序列如seq id no.5所示。
8.本发明的甲醇脱氢酶mdh和mdh激活蛋白act来自甲醇芽孢杆菌mga3，3-己酮糖-6-磷酸合酶hps、6-磷酸-3-己酮异构酶phi、nadh脱氢酶ndh来自枯草芽孢杆菌。
9.进一步地，所述的3-己酮糖-6-磷酸合酶hps、6-磷酸-3-己酮异构酶phi、nadh脱氢酶ndh采用pveg启动子启动表达，所述的甲醇脱氢酶mdh和mdh激活蛋白act采用p566启动子启动表达。
10.进一步地，所述的pveg启动子的核苷酸序列如seq id no.6、seq id no.10或seq id no.11所示。
11.进一步地，所述的p566启动子的核苷酸序列如seq id no.7所示。
12.进一步地，所述的宿主为野生型苏云金芽孢杆菌hd-1(genbank号:cp001903)。
13.本发明的第二个目的是提供所述的苏云金芽孢杆菌在农业、食品中的应用。
14.进一步地，所述的应用是以甲醇为碳源，利用苏云金芽孢杆菌发酵生产目的产物。
15.本发明的有益效果是：
16.本发明通过在野生型苏云金芽孢杆菌中引入甲醇脱氢酶mdh、mdh激活蛋白act、3-己酮糖-6-磷酸合酶hps、6-磷酸-3-己酮异构酶phi和nadh脱氢酶ndh，首先实现了苏云金芽孢杆菌消耗0.71g/l甲醇，进一步，通过将pveg启动子替换为突变后的pveg启动子，将甲醇消耗量提升至11.7倍，达8.3g/l。
附图说明
17.图1为苏云金芽孢杆菌中引入的甲醇同化途径。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
19.涉及材料和方法：
20.菌株：野生型苏云金芽孢杆菌hd-1(genbank号:cp001903)。
21.无机盐培养基：5g/l葡萄糖，10g/l甲醇，1g/l胰蛋白胨，0.5g/l酵母提取物，1g/l nacl，17g/l na2hpo4，3g/l kh2po4，0.6g/l nh4cl，0.21g/l一水合柠檬酸，0.015g/l cacl2·
h2o，2.5g/l mgso4·
7h2o，0.1mg/l cocl2·
h2o，0.1mg/l cuso4·
5h2o，13.5mg/l fecl3·
6h2o，0.33mg/l mnso4·
h2o，3.8mg/l znso4·
7h2o，使用氨水调节ph至7.0。
22.lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl 10
23.sg缓冲液：每l含蔗糖93.1g、甘油150ml
24.0.1m pbs：每100ml含k2hpo
4 1.4g、kh2po
4 0.52g
25.1m mgcl2：每100ml含mgcl2·
6h2o 20.33g
26.ep缓冲液：每l含sg缓冲液1l、0.1m pbs 5ml、1.0m mgcl
2 500μl。
27.实施例1：苏云金芽孢杆菌的电转化
28.感受态制备：首先挑取单菌落于5ml lb培养基中，30℃活化培养过夜。然后按1/100的接种量转接至新鲜的lb培养基中，30℃、220r/min培养至od600约等于1.0-1.3(约2h)后冰浴冷却10-30min，整个感受态制作及转化过程均应在低温条件进行。冷却结束后，将菌液以5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，弃上清。然后相同条件用预冷的ep缓冲液清洗菌体2次，使用预冷的sg缓冲液清洗菌体1次，最后将菌体重悬于sg缓冲液中(约加入1.5ml)，使感受态od600约为50-70；将感受态50μl/管分装于离心管中，-80℃存放备用，或500μl/管分装于离心管中，现用现分装。
29.电转化过程：取1管感受态细胞放置冰上，加入3-5μl质粒dna(质粒浓度100ng/μl以上，必须使用大肠杆菌jm110作为克隆宿主，否则质粒会被限制性切割导致转化失败)，稍微震荡混匀，冰浴10-30min后加入到1mm预冷的电转杯中，1.25kv电击后迅速加入500μl 37℃预热的lb培养基；37℃，220r/min恢复培养2h后涂布抗性平板，37℃培养箱内培养过夜。
30.实施例2：甲醇利用苏云金芽孢杆菌构建
31.首先构建了辅助质粒pbmb-esc(序列为seq id no.8)以实现苏云金芽孢杆菌hd-1高效重组。表达甲醇利用基因簇的线性质粒(序列为seq id no.9)，其整合框的构建采用融合pcr的方式。具体操作为：首先设计同源臂长度为500-1000bp的重组框，使用引物hd-meth-1f：tggagcaggctttatacatgcgaagg、hd-meth-1r：gaaattgttatccgctccgtcacacgtgtg
tcattttggac扩增左臂，使用引物hd-meth-2f：cacgtgtgacggagcggataacaatttcacacaggaaacagc、hd-meth-2r：gcaagctgtaattccatttttatcacctcctttcactacatttattgtacaacacg扩增壮观霉素抗性蛋白表达框，使用引物hd-meth-3f：gtgaaaggaggtgataaaaatggaattacagcttgcattagacctcgtc、hd-meth-3r：ccgtcctttatatcctattcaaggtttgcgtggtgagtgaac扩增3-己酮糖-6-磷酸合酶hps和6-磷酸-3-己酮异构酶phi表达框，使用引物hd-meth-4f：ccacgcaaaccttgaataggatataaaggacggaggatatacgatgtcaaaac、hd-meth-4r：cacgaaccggaaaggaatgcttttggcaatgcc扩增ndh表达框，使用引物hd-meth-5f：ccaaaagcattcctttccggttcgtgttcgtgctgacttgc、hd-meth-5r：ggccgttttttgtctagggacctctttagctccttgg扩增红霉素抗性蛋白表达框，使用引物hd-meth-6f：ctaaagaggtccctagacaaaaaacggcctctcgaaatagagggttg、hd-meth-6r：cagtttgcccatttttctcacctcctttctataattcattacatcgcgtttttgataatttggatcac扩增mdh表达框，使用引物hd-meth-7f：gaaaggaggtgagaaaaatgggcaaactgtttgaagaaaaaacgatc、hd-meth-7r：gcccagcgtgatcattatttatgtttcagcgcttcttgcagc扩增act表达框，使用引物hd-meth-8f：cgctgaaacataaataatgatcacgctgggcataactactttgtg、hd-meth-8r：caattacggcttgtgcttcctctcg扩增右臂。获得的dna片段纯化后相应的线性质粒/基因组整合操作为：
32.首先制备含pbmb-esc质粒的菌株的感受态，当菌液od600约为0.5时加入终浓度3％的木糖，继续培养至od600约等于1.0-1.3。其余操作与电转化质粒相同。电转化时，dna片段需较为单一，加入5μl浓度200ng/μl以上的dna片段，后培养3h。其余操作与电转化质粒相同，最终dna整合框实现原噬菌体gil16基因组的重组编辑，获得含有完整甲醇利用途径的苏云金芽孢杆菌。
33.对此苏云金芽孢杆菌的甲醇消耗水平进行测试：首先挑取单菌落于5ml lb培养基中，37℃培养过夜。然后按1/100的接种量转接至无机盐培养基中，37℃、220r/min培养24h后，离心取上清。分别测定空培养基与发酵上清中甲醇含量，计算甲醇消耗量。经过测定，在无机盐培养基中甲醇消耗量为0.71g/l的苏云金芽孢杆菌。
34.实施例3：高效利用甲醇苏云金芽孢杆菌的构建
35.在上述甲醇利用苏云金芽孢杆菌基础上，通过使用突变的pveg启动子改变包含3-己酮糖-6-磷酸合酶hps、6-磷酸-3-己酮异构酶phi和nadh脱氢酶ndh基因簇的表达水平。分别使用pveg启动子的中表达水平突变序列(seq id no.10，相对转录强度为pveg启动子的27.8％)与低表达水平突变序列(seq id no.11，相对转录强度为pveg启动子的3.9％)替换pveg启动子。经过甲醇消耗水平测定，发现使用中表达水平突变序列时甲醇消耗提高至2.2g/l，使用低表达水平突变序列时甲醇消耗提高至8.3g/l。代谢工程改造后，甲醇消耗提升至11.7倍，实现了苏云金芽孢杆菌甲醇的高效利用。
36.对比例1：野生型苏云金芽孢杆菌甲醇消耗量测定
37.对野生型苏云金芽孢杆菌的甲醇消耗水平进行测试：首先挑取单菌落于5ml lb培养基中，37℃培养过夜。然后按1/100的接种量转接至无机盐培养基中，37℃、220r/min培养24h后，离心取上清。分别测定空培养基与发酵上清中甲醇含量，计算甲醇消耗量。经过测定，野生型苏云金芽孢杆菌在无机盐培养基中不消耗甲醇。
38.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明
的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。