根结线虫侵染黄瓜定量检测内参基因筛选及应用

1.本发明属于植物分子生物技术领域，具体涉及根结线虫侵染黄瓜定量检测内参基因筛选及应用。


背景技术：

2.近年来，随着我国种植产业结构的不断调整，我国设施栽培产业处于不断发展的状态。黄瓜是我国设施栽培重要蔬菜作物，在世界范围内大量种植，由于设施栽培中存在连作障碍以及复种指数不断提高等问题，导致大量病虫害不断发生，严重影响黄瓜的生长发育以及其产品品质，降低产量。优质高抗的品种是黄瓜绿色高效生产的重要保障，而优良品种的培育离不开高效的育种技术，由于黄瓜遗传背景狭窄，在全基因组序列信息破译之前，相关分子生物学研究进展缓慢。目前黄瓜因具有基因数量少、适合维管作物研究、生命周期较短、根癌农杆菌介导转化等理想的特性被开发为植物生物学中的新模式物种。因此从黄瓜的基因组序列中进一步研究黄瓜的分子生物学变得更加现实，并积累了遗传学和基因组学相关方面的资源。
3.根结线虫病是一种重要的土传病害，危害蔬菜的根系，主要表现为侧根和须根增多，通过寄生在蔬菜作物的幼根上并形成根结，诱导植物细胞转化为巨细胞，即线虫特异性的取食位点，并从中摄取营养物质用来维持其本身的生长发育和繁殖，进而破坏蔬菜作物根系细胞的组织结构与活力，严重阻碍矿质营养及水分的运输，导致植株地上部生长矮小、缓慢、叶色发黄、营养失调、结果少，产量低甚至绝收，严重会造成植株提早死亡。根结线虫病害是黄瓜生产中导致黄瓜减产的重要病害。南方根结线虫是一种专性寄生生物，具有适应性强、寄主范围广等特点；同时其口针穿刺黄瓜表面，会导致病原菌对作物造成复合侵染，加重其对作物的危害。目前，黄瓜的根结线虫防治仍以化学防治为主，但化学药剂具有毒性高、效果差，且污染环境、影响产品的质量安全的不利因素，越来越多的化学农药被禁用，导致根结线虫的防治工作愈加困难。因此，通过分子手段
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基因调控措施防治根结线虫已成为研究重点。
4.使用基因表达模式分析是揭示基因表达调控机制与功能的重要方法。实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，rt-qpcr)具有定量准确、灵敏度高、特异性强、重复性好以及操作简单等特点，已被广泛应用于基因的表达分析。但其分析结果的准确性容易受到rna完整性、cdna质量、引物特异性等多种因素的影响。因此，为了获得准确、可靠的基因表达结果，rt-qpcr结果必需配以合适的内参基因来进行校正和标准化，以消除这些因素造成的干扰。目前在黄瓜生长发育和非生物胁迫表达稳定的内参基因如tub和act常被选择，然而，研究发现一些肌动蛋白在线虫侵染过程中发挥作用，内参基因act可能不适用线虫胁迫下黄瓜的内参基因。因此，选择能够在线虫胁迫下稳定表达的内参基因是研究黄瓜响应线虫反应的分子机制的关键。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供根结线虫侵染黄瓜定量检测内参基因筛选及应用，利用简单方法筛选到黄瓜特定事件下的稳定内参基因，针对不同的实验要求选择不同的内参基因，从而得到更为精准的效果。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种针对事件筛选稳定内参基因的方法，包括以下步骤：(1)收集事件主体的已知内参基因作为候选内参基因；
8.(2)对事件主体设定事件，并分别提取事件部位和包含事件部位的整体组织的rna，反转录为cdna后作为模板，利用所述候选内参基因的引物对进行qrt-pcr；
9.(3)对候选内参基因在事件部位和包含事件部位的整体组织的表达稳定性进行分析，并选择reffind算法进行综合分析，筛选出针对特定事件的稳定内参基因。
10.优选的，步骤(1)所述事件主体包括黄瓜。
11.优选的，步骤(1)所述事件主体的候选内参基因包括：act、tua、ubc、ef1、cyp、prl36aa、pp2a、ubi、cacs、ubq、f-box、ysl8和pdf2。
12.优选的，步骤(2)所述事件包括感染南方根结线虫病；
13.所述事件部位包括根结；
14.所述包含事件部位的整体组织包括整根。
15.优选的，步骤(3)采用genorm法、norm finder法、best keeper法和δct法进行表达稳定性分析。
16.本发明还提供了利用上述方法筛选得到的稳定表达内参基因，包括在南方根结线虫胁迫黄瓜的根结组织中表达稳定的efi；在黄瓜的全根组织中表达稳定的ubi。
17.本发明还提供了上述稳定表达内参基因在南方根结线虫胁迫下黄瓜基因定性检测中的应用。
18.本发明还提供了上述稳定表达内参基因在南方根结线虫胁迫下黄瓜基因定量检测中的应用。
19.本发明还提供了上述稳定表达内参基因在筛选黄瓜抗南方根结线虫基因中的应用。
20.本发明还提供了上述稳定表达内参基因在筛选抗南方根结线虫的黄瓜种质中的应用。
21.有益效果：本发明提供了一种针对事件筛选稳定内参基因的方法，只需要对事件主体的已知内参基因，在事件发生后进行qrt-pcr，对表达量进行稳定性分析即可得到对应事件的稳定内参基因。如在本发明实施例中，共筛选出13个候选内参基因，采用实时定量pcr检测其候选内参基因在南方根结线虫处理下，不同组织部位(根结和全根)的表达情况，首先分析不同内参基因的ct值得变化范围，确定13个候选内参基因在线虫胁迫下不同时期的表达变化，进一步通过采用genorm法、norm finder法和best keeper法和reffinde法，对其候选内参基因在黄瓜中的表达变化进行比较分析，筛选出特定条件下表达稳定的内参基因，为进一步开展黄瓜响应南方根结线虫分子生物学研究奠定方法学基础。
22.经分析结果表明，基因csa3g358610(ubc)在全部处理特定条件下是相较13中最稳定的内参，该基因的鉴定为黄瓜响应南方根结线虫分子机理研究提供了稳定的内参，其在
南方根结线虫胁迫下的表达稳定；csa6g484600(act)、csa3g358610(ubc)、csa2g139820(ef1)、csa3g653380(prl36aa)、csa2g036600(ubi)和csa3g902930(cacs)具有良好的表达稳定性，可用作一般实时荧光定量pcr的内参。然而，根据不同的试验要求选择不同的内参基因也是极为重要的。比如，本发明实施例中内参基因csa2g139820(ef1)在线虫胁迫下的根结样品中是表达最稳定的内参基因，但是其在全根样品中的表达并不是最稳定。
附图说明
23.图1为候选内参基因引物特异性检测图；其中a：候选内参基因引物扩增检测的电泳图；第1条带是marker，后面2-14分别对应1-13个内参引物的rt-pcr结果；b：候选内参基因实时荧光定量的溶解曲线图；
24.图2为13个候选内参基因在不同样本中的全部ct值分布图；
25.图3为13个候选内参基因的表达稳定性genorm分析图，其中a：是经过南方根结线虫处理后在0、7、14、21、28和35天的根结样本；b：经过南方根结线虫处理后在0、7、14、21、28和35天的全根样本。
具体实施方式
26.本发明提供了一种针对事件筛选稳定内参基因的方法，包括以下步骤：(1)收集事件主体的已知内参基因作为候选内参基因；
27.(2)对事件主体设定事件，并分别提取事件部位和包含事件部位的整体组织的rna，反转录为cdna后作为模板，利用所述候选内参基因的引物对进行qrt-pcr；
28.(3)对候选内参基因在事件部位和包含事件部位的整体组织的表达稳定性进行分析，并选择reffind算法进行综合分析，筛选出针对特定事件的稳定内参基因。
29.本发明首先收集事件主体的已知内参基因作为候选内参基因，所述事件主体优选包括黄瓜。本发明优选运用生物信息学及查阅文献的方式，获得13个在黄瓜中稳定表达的内参基因(表1)，作为本发明的候选内参基因。
30.表1候选内参基因
31.[0032][0033]
在得到后续内参基因后，本发明对事件主体设定事件，并分别提取事件部位和包含事件部位的整体组织的rna，反转录为cdna后作为模板，利用所述候选内参基因的引物对进行qrt-pcr。在本发明实施例中所述事件优选包括感染南方根结线虫病，更优选为利用南方根结线虫感染黄瓜幼苗，在具体操作时，对生长3周龄的黄瓜幼苗，接种j2时期的线虫，每株接种500条线虫，分别于0天、7天、14天、21天、28天和35天取南方根结线虫侵染的根结(事
件部位)和全根(包含事件部位的整体组织)，以及对照未侵染根结和全根。
[0034]
本发明优选对上述根结和全根进行rna的提取，所述提取的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行提取即可。本发明实施例中优选通过试剂盒法提取rna，并反转录为cdna，经稀释后作为qrt-pcr的模板。
[0035]
本发明所述qrt-pcr优选在abi 7500real time pcr系统(applied biosystems，usa)上进行，并采用green i(chamq sybr qpcr master mix)(诺唯赞，北京，中国)。本发明对每一个内参基因设计一个qrt-pcr反应体系，所述qrt-pcr反应体系以10μl计，优选包含：2μl cdna稀释剂、0.2μl正向引物、0.2μl反向引物、2.6μl ddh2o和5μl sybr(chamq sybr qpcrmastermix)。本发明所述qrt-pcr的反应程序，优选设置为94℃30s；40个循环：94℃5s，60℃34s，每个样品设置3个技术重复。
[0036]
进行所述qrt-pcr后，本发明对候选内参基因在事件部位和包含事件部位的整体组织的表达稳定性进行分析，并选择reffind算法进行综合分析，筛选出针对特定事件的稳定内参基因。本发明在进行所述qrt-pcr后，优选还包括提取ct值，ct值与基因的表达丰度呈负相关，即ct值越低，基因的表达丰度越高；且ct值在不同样品中的变化范围越小，表明该内参基因表达越稳定。在本发明实施例中，13个候选内参基因在所有的cdna样本中均有一定丰度的表达，ct值大部分分布在16-32之间；其中cyp基因的表达丰度最高，其ct值在检测样本中为16-23；而pdf2的表达丰度较低，ct值为23-37之间。
[0037]
本发明优选采用genorm法、norm finder法、best keeper法和δct法进行表达稳定性分析，根据qrt-pcr结果获得各基因的ct值；数据通过公式进行转换，并导入genorm(vandesompele et al.,2002,accurate normalization of real-time quantitative rt-pcr data by geometric averaging of multiple internal control genes.)和norma finder(andersen et al.,2004,normalization ofreal-time quantitative reverse transcription-pcr data:a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization,applied to bladder and colon cancer data sets.)以评估表达稳定性。
[0038]
在本发明中，genorm用于计算所有候选基因的平均表达稳定性m值以及一对基因和其他基因的平均成对变异vn/vn+1值。根据每个候选基因的m值得出每个基因的稳定性排序，并指出最合适的内参基因数。m值得分越低的内参基因其表达量越稳定，而m值得分越高的内参基因的表达变化越大，越不稳定。norm finder计算一组候选基因的稳定值(s)，并将其从低到高排序，即s值越高，基因表达越不稳定，s值越低，基因表达越稳定，以获得具有最佳表达稳定性的基因。bestkeeper可以直接分析得到的ct值，通过计算ct得到标准偏差(sd)和变异系数(cv)，从而判断参考品的稳定性。sd越小，调节系数标准差越小，基因的稳定性就越好。当sd》1时，内参基因表达不稳定。δct方法通过分析每个候选基因的平均标准偏差对每个基因的稳定性进行排序，平均标准差越小，稳定性越强。reffinder(duan et al.,2017,identification of optimal reference genes for expression analysis in radish(raphanus sativus l.)and its relatives based on expression stability.)是一种综合稳定性评估方法，它根据上述四种算法的结果为每个候选基因分配适当的权重，并通过计算四种算法稳定值权重的几何平均值进行总体综合性的排序，有效避免了单一评估算法的片面性和偶然性，稳定性值越小，稳定性越好。
[0039]
利用本发明所述筛选方法，在南方根结线虫胁迫黄瓜的根结组织中筛选出表达最稳定的efi；在全根组织中表达最稳定的是ubi。根据不同的根部组织选择不同的内参基因用作实时荧光定量pcr的稳定内参，为黄瓜的抗病分子生物学研究奠定方法学基础。
[0040]
本发明还提供了利用上述方法筛选得到的稳定表达内参基因，包括在南方根结线虫胁迫黄瓜的根结组织中表达稳定的efi；在黄瓜的全根组织中表达稳定的ubi。
[0041]
本发明还提供了上述稳定表达内参基因在南方根结线虫胁迫下黄瓜基因定性检测中的应用。
[0042]
本发明还提供了上述稳定表达内参基因在南方根结线虫胁迫下黄瓜基因定量检测中的应用。
[0043]
本发明所述定量检测优选包括以筛选到的内参基因作为内参，进行与上述相同的qrt-pcr，并获得相对表达量，从而对目标基因的表达量进行定量检测。
[0044]
本发明还提供了上述稳定表达内参基因在筛选黄瓜抗南方根结线虫基因中的应用。
[0045]
本发明还提供了上述稳定表达内参基因在筛选抗南方根结线虫的黄瓜种质中的应用。
[0046]
下面结合实施例对本发明提供的根结线虫侵染黄瓜定量检测内参基因筛选及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0047]
实施例1
[0048]
1、黄瓜材料处理与rna提取、cdna合成
[0049]
(1)实验材料获取
[0050]
黄瓜(cucumis sativus l.)，使用新泰密刺自交系品种。黄瓜种子在25℃的黑暗中萌发，萌发24h后种植在黑色托盘中，每个托盘中有24个边长是6cm方形的小黑盆，其中小黑盆里沙子:蛭石(v:v)＝1:1。
[0051]
黄瓜生长的环境为光照28℃，黑暗18℃，相对湿度75％～90％，光周期7天，每周浇两次标准营养液，其余时期浇水。
[0052]
侵染黄瓜j2期南方根结线虫来源于空心菜植株的根中：采集空心菜根表面的卵块，置于无菌水中孵化，孵化温度为28℃，卵化7天。
[0053]
对生长3周龄的黄瓜幼苗的接种j2时期的线虫，每株接种500条线虫。分别于0天、7天、14天、21天、28天和35天取南方根结线虫侵染的根结(treatment1)和全根(treatment2)，以及对照未侵染根结(treatment1)和全根(treatment2)。
[0054]
(2)rna提取与互补dna合成
[0055]
在液氮条件下，将样品快速研磨成粉末，将约100mg的根组织放入1.5ml离心管中。按照rna纯植物总rna提取试剂盒(北京华越洋rna提取试剂盒)的说明提取总rna。通过分光光度计测量rna样品的浓度和纯度。为除去rna中残留的基因组dna，用dnase i(ambion)对1μg的总rna进行消化。取消化后的样品进行cdna第一链的合成，然后按照北京天根的反转录试剂盒的反转录程序的说明进行，反应体系为20μl，反应结束后稀释5倍，为后续用于实时荧光定量pcr。
[0056]
2、rna质量检测和引物特异性分析
[0057]
从多个rna样品中随机选取几个进行琼脂糖凝胶电泳，检测rna的完整性，其中有
三条带：5s、18s和28s。
[0058]
进一步对提取的rna样品用nano drop 2000(thermo scientific)测定浓度和纯度，其中rna的浓度均在100ng/μl以上，rna的a
260
/a
280
比值均在1.8～2.0之间。
[0059]
对筛选的内参基因引物(1)进行pcr(pcr程序预变性95℃3min；变性95℃30s退火5530s延伸72℃20s共35个循环；72℃5min；4℃∞；pcr体系：mix:10μl,f:0.5μl,r:0.5μl,模板cdna:1μl,ddh2o补足至20μl)和qrt-pcr反应(程序和体系同下所述实时荧光定量pcr分析)，鉴定引物的特异性。电泳结果如图1所示，不同的内参基因的引物只有一条特异性条带，该条带与预期条带大小一致，说明设计的引物具有高度的特异性；qrt-pcr反应溶解曲线只有一个高峰，进一步说明了所用引物具有高度的特异性。
[0060]
3、实时荧光定量pcr分析
[0061]
采用green i(chamq sybr qpcr master mix)(诺唯赞，北京，中国)在abi 7500real time pcr系统(applied biosystems，usa)上进行qrt-pcr。对于每个qrt-pcr反应混合物，构建了一个10μl的系统，其中包含2μl cdna稀释剂、0.2μl正向引物、0.2μl反向引物、2.6μl ddh2o和5μl sybr(chamq sybr qpcrmastermix)。pcr反应程序设置为94℃30s；40个循环在94℃5s，然后在60℃34s，每个样品设置3个技术重复。
[0062]
根据其对应ct值判断基因的表达丰度，13个候选内参基因在所有的cdna样本中均有一定丰度的表达，ct值大部分分布在16-32之间(图2)；其中cyp基因的表达丰度最高，其ct值在检测样本中为16-23；而pdf2的表达丰度较低，ct值为23-37之间。
[0063]
4、基因表达稳定性分析
[0064]
使用四种广泛使用的算法软件genorm法、norm finder法和bestkeeper法和δct法方法评估了黄瓜中13个候选内参基因的表达稳定性。根据qrt-pcr结果获得各基因的ct值。数据通过公式进行转换，并导入genorm和normafinder以评估表达稳定性。genorm和normafinder算法用到数据为2-驻ct值
，计算驻ct值，先找到该基因在所有样品中的最小的ct(表达量最高)，再用其他ct值减去最低ct值，即驻ct值。genorm算法中要求第一列为试验样品，第一行为要筛选的内参基因，第一列第一行的单元格为空。然后将数据导入genorm程序中，点击calculate按钮进行计算m值，根据m值的大小分析各个内参基因的稳定性。而normafinder算法则要求第一行为试验样品，第一列为要筛选的内参基因，第一列第一行的单元格也必须为空。将数据导入normafinder软件中点击go按钮，便可获得各个内参基因稳定性s值。
[0065]
(1)genorm法分析内参基因稳定性
[0066]
m值如图3所示，在treatment 1的样品内参基因表达稳定性最高的是tua和ubc，较不稳定的是f-box，但是全部内参的m值均低于1.5，m值若高于1.5表明其不能用于作内参基因，表明这13个候选内参基因在genorm算法中均可做内参基因；treatment 2的样品内参基因表达稳定性最高的是ubc和rpl36aa，最不稳定的是yls8，且仅有yls8的m值大于1.5，表明其在全根样品中表达不稳定不能用于作内参基因。
[0067]
(2)normfinder法分析内参基因稳定性
[0068]
s值如表2所示，在treatment 1的样品内参基因表达稳定性最高的是efi，最不稳定的是f-b0x，这与genorm法分析结果一致；treatment 2的样品内参基因表达稳定性最高的是ubi，最不稳定的是yls8。
[0069]
表2 norm finder法分析s值
[0070][0071]
(3)bestkeeper法分析内参基因稳定性
[0072]
通过qrt-pcr可以获得每个候选基因的表达ct值。基于genorm程序和normfinder分析，从13个候选内参基因中筛选出10个稳定性较高的内参基因进行bestkeeper分析。采用best keeper软件对筛选出的黄瓜10个内参候选基因的表达稳定性进行分析的结果显示(表3)，在treatment 1的样品内参基因表达稳定性最高的是prl36aa，且这10个所有内参基因的sd均小于1，表明这10个均可以作为线虫胁迫黄瓜的内参基因；而在treatment2样品内参基因表达稳定性最高ubi，其中tua、ef1、pp2a、pdf2、ubq这5个内参基因的sd值大于1，表明这5个基因不适合作为线虫胁迫黄瓜全根样品的内参基因。
[0073]
表3 bestkeeper法分析内参基因稳定性结果
[0074][0075]
(4)δct法分析内参基因稳定性
[0076]
结果如表4所示(排名从better-good-average)，在treatment 1的样品内参基因表达稳定性最高的是efi，最不稳定的是f-box；treatment 2的样品内参基因表达稳定性最高的是ubi，最不稳定的是yls8，这与norm finder法分析结果一致。
[0077]
表4 reffinder分析综合排名
[0078]
[0079][0080]
(5)reffinder分析综合排名
[0081]
reffinder分析结果表4所示，在treatment 1中表达最稳定的候选基因是efi；在treatment 2中表达最稳定的候选基因是ubi。
[0082]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。