一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法。


背景技术：

2.骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中具有干性的一类细胞，对动物的肌肉生长发育和再生具有关键作用，也是目前细胞培养肉(利用细胞培养工程和组织工程等技术，在体外培养动物肌肉组织作为食用材料)的种子细胞之一。
3.当前有多项与鸡、猪、羊、牛等动物的骨骼肌卫星细胞分离相关的专利报道，但都存在诸如问题，例如：1、分离得到的骨骼肌卫星细胞在体外培养容易失去增殖和分化形成肌管的能力，2、由于骨骼肌卫星细胞在肌肉中含量少，这些方法每次只能分离得到极少细胞，提取效率低。因此，这种单纯依靠分离动物肌肉中的骨骼肌卫星细胞诱导分化获得大量肌管，从而得到大量细胞培养肉的策略，仍面临巨大挑战。
4.另一种解决方案是通过诱导多能干细胞往肌肉祖细胞方向分化，再进一步分化得到肌管。但是该方法诱导时间过长，操作复杂，且多能干细胞的来源也是一大难题。因此，不经历多能干细胞阶段，直接将成纤维细胞转分化为肌管更具优势。有研究基于小鼠试验通过在成纤维细胞中过表达myod1基因，获得肌管，但这一操作需要应用转基因技术，存在安全风险。
5.因此，如何提供一种操作简便、易于标准化、安全性高、无需转入外源基因、无需经历多能干细胞阶段，直接将成纤维细胞转分化为肌管的方法，成为了本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法。
7.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，所述方法包括如下步骤：
9.(1)接种羊成纤维细胞，利用基础培养基进行一次培养；
10.(2)去除基础培养基，换用诱导培养基进行二次培养，所述诱导培养基中含有小分子化合物，所述小分子化合物包括chir99021、forsklin或repsox中的任意一种或至少两种的组合；
11.(3)去除诱导培养基，换用分化培养基进行三次培养，即得。
12.优选地，所述小分子化合物包括chir99021、forsklin和repsox。
13.优选地，所述诱导培养基中还含有bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)和/或维生素c。
14.优选地，所述诱导培养基中的组分以浓度计包括dmem 70-90％w/w、血清替代物5-15％w/w、fbs 5-15％w/w、bfgf 5-15ng/ml、维生素c 40-60μg/ml、chir99021 1-5μm、forsklin 5-50μm和repsox 5-50μm。
15.本发明所述w/w是指质量比。
16.上述70-90％中的具体数值例如70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％等。
17.上述5-15％中的具体数值例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
18.上述5-15ng/ml中的具体数值例如5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml等。
19.上述40-60μg/ml中的具体数值例如40μg/ml、42μg/ml、44μg/ml、46μg/ml、48μg/ml、50μg/ml、52μg/ml、54μg/ml、56μg/ml、58μg/ml、60μg/ml等。
20.上述1-5μm中的具体数值例如1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm等。
21.上述5-50μm中的具体数值例如5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm等。
22.优选地，所述基础培养基中含有dmem、双抗和fbs。
23.本发明所述双抗是指青霉素和链霉素混合物。
24.优选地，所述基础培养基以质量百分含量计包括dmem 84-94％、双抗0.5％-1.5％和fbs 5-15％。
25.上述84-94％中的具体数值例如84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等。
26.上述0.5％-1.5％中的具体数值例如0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等。
27.上述5-15％中的具体数值例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
28.优选地，所述分化培养基为含有马血清的dmem/f12培养基。
29.优选地，所述马血清在分化培养基中的质量百分含量为1.5-2.5％，例如1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％等。
30.优选地，所述一次培养、二次培养和三次培养的温度各自独立地为35-40℃，例如35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃等。
31.优选地，所述一次培养的时间为0.5-1.5天。
32.优选地，所述二次培养的时间为4-7天。
33.优选地，所述三次培养的时间为2-4天。
34.上述0.5-1.5天中的具体数值例如0.5天、1天、1.5天等。
35.上述4-7天中的具体数值例如4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天等。
36.上述2-4天中的具体数值例如2天、2.5天、3天、3.5天、4天等。
37.优选地，所述接种是指接种在明胶包被的细胞培养板上。
38.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值
范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
39.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
40.本发明的方法成功实现了诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管，不涉及转入外源基因，无需先诱导成纤维细胞重编程为多能干细胞，再分化得到肌管，操作方便，易于标准化，获得的肌管安全性好。
41.本发明创造性地在诱导培养基中同时添加chir99021、forsklin和repsox，三种小分子化合物相互配合，实现了诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管，并显著促进了转分化效率的提升，chir99021、forsklin和repsox在诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管方面具有协同增效的功效。
42.本发明意外地发现bfgf和维生素c起到了辅助本发明的小分子化合物诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的作用。
附图说明
43.图1是羊成纤维细胞在显微镜下的观察结果图，图上右下角的标尺表示100μm。
44.图2是羊成纤维细胞经实施例1的方法诱导转分化得到的肌管在显微镜下的观察结果图，箭头指示的是肌管，图上右下角的标尺表示100μm。
具体实施方式
45.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
46.以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
47.下述实施例、对比例所述及的原料信息如下：
48.chir99021：一种gsk-3抑制剂，购自selleck公司，货号s1263。
49.forsklin：腺苷酸环化酶激活剂，购自selleck公司，货号s2449。
50.repsox：一种tgfβr-1/alk5抑制剂，购自selleck公司，货号s7223。
51.明胶购自stemcell公司，货号7903。
52.马血清购自gibco公司，货号26050088。
53.bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)购自peprotech公司，货号100-18b。
54.下述实施例、对比例所涉及的羊成纤维细胞(sff)的制备方法如下：
55.将羊胎儿连带子宫一起取下，放入pbs中，低温运到实验室。用灭菌后的剪刀小心剥离胎儿及胎衣，将胎儿放置在pbs中，用剪刀取羊胎儿皮肤组织，pbs冲洗三遍，剪碎胎儿皮肤组织，直至无明显组织块即可，加入新鲜配制的消化液10ml-15ml，放入培养箱中消化2-4h，期间观察消化情况，消化完毕后，将其转移到15ml的离心管中，1000rpm离心8min收集细胞，弃上清后将细胞用dmem+10％fbs(胎牛血清)清洗两次，200g离心5min收集细胞，将细胞沉淀用dmem+10％fbs重悬铺板。
56.在显微镜下观察羊成纤维细胞，并拍照，见图1。
57.实施例1
58.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，具体步骤如下：
59.使用制备的羊成纤维细胞(sff)接种在提前用0.1％明胶包被过的6孔板，每个孔接种50000个细胞，培养基为基础培养基(高糖dmem(葡萄糖含量4.5g/l)，1％双抗(青霉素-链霉素)，10％fbs)置于5％二氧化碳，湿度95％，37℃的培养箱中。培养24小时后，去除基础培养基，用pbs洗三次，更换为诱导培养基，培养基配方：knockout
tm dmem、10％fbs、10％knockout
tm serum replacement(血清替代物)、10ng/ml bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)、50μg/ml维生素c和三种小分子化合物(3μm chir99021、20μm forsklin、20μmrepsox)，每隔一天更换诱导培养基；诱导培养六天后，去除诱导培养基，用pbs洗三次，更换为分化培养基，分化培养基配方：dmem/f12，2％马血清，培养3天，获得转分化的肌管。
60.所述0.1％明胶包被的具体方法为：将0.1％明胶提前加到培养板中，置于5％二氧化碳、湿度95％、37℃的培养箱中30分钟后，弃掉0.1％明胶，用pbs洗三次，即可用于接种细胞。
61.实验后在显微镜下观察转分化情况，结果见图2，与图1对比可知，细胞变得拉长融合在一起，呈现出肌管的形态，充分证实了采用本实施例的方法成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
62.实施例2
63.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方不同，将“3μm chir99021、20μm forsklin、20μm repsox”替换为“1μm chir99021、5μm forsklin、5μm repsox”，其他条件不变。
64.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
65.实施例3
66.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方不同，将“3μm chir99021、20μm forsklin、20μm repsox”替换为“5μm chir99021、50μm forsklin、50μm repsox”，其他条件不变。
67.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
68.实施例4
69.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方不同，将“3μm chir99021、20μm forsklin、20μm repsox”替换为“21.5μm forsklin、21.5μm repsox”，其他条件不变。
70.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
71.实施例5
72.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方不同，将“3μm chir99021、20μm forsklin、20μm repsox”替换为“3μm chir99021、20μm forsklin”，缺少的量用等质量的knockout
tm dmem补足，其他条件不变。
73.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
74.实施例6
75.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方不同，将“3μm chir99021、20μm forsklin、20μm repsox”替换
为“3μm chir99021、20μm repsox”，缺少的量用等质量的knockout
tm dmem补足，其他条件不变。
76.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
77.实施例7
78.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方不同，将“3μm chir99021、20μm forsklin、20μm repsox”替换为“3μm chir99021”，缺少的量用等质量的knockout
tm dmem补足，其他条件不变。
79.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
80.实施例8
81.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方不同，将“3μm chir99021、20μm forsklin、20μm repsox”替换为“20μm forsklin”，缺少的量用等质量的knockout
tm dmem补足，其他条件不变。
82.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
83.实施例9
84.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方不同，将“3μm chir99021、20μm forsklin、20μm repsox”替换为“20μm repsox”，缺少的量用等质量的knockout
tm dmem补足，其他条件不变。
85.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
86.实施例10
87.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方中缺少bfgf，缺少的量用等质量的knockout
tm dmem补足，其他条件不变。
88.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
89.实施例11
90.本实施例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方中缺少维生素c，缺少的量用等质量的knockout
tm dmem补足，其他条件不变。
91.本实施例成功诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
92.对比例1
93.本对比例提供一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，其与实施例1的区别仅在于，诱导培养基配方不同，不含有chir99021、forsklin和repsox，缺少的量用等质量的knockout
tm dmem补足，其他条件不变。
94.本对比例无法实现诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管。
95.测试例
96.利用免疫荧光对肌管进行鉴定
97.对上述显微镜观察结果为“成功转分化”的实施例得到的肌管进行进一步免疫荧光鉴定，检测肌管的标记性抗原，即肌球蛋白重链(myosin heavy chain，myhc)的表达情况。
98.用pbs洗涤3次，多聚甲醛(4％)进行固定15min，将固定后的细胞用pbs洗涤3次，每
次5min，用tritionx-100通透液在室温(25℃)下透化10min，pbs洗涤3次，每次5min。加入5％羊血清于室温中封闭1h，pbs洗涤3次，每次5min。按照1:1000的比例将一抗用1％的羊血清稀释，加完一抗后将其放到4℃环境下过夜孵育。第二天取出放到室温下先让其复温，然后pbs洗涤3次，每次5min。根据抗体的稀释倍数将二抗也同样用1％的bsa(牛血清白蛋白)稀释，然后pbs洗3次，每次5min。通过荧光显微镜观察并拍照记录。
99.计算转分化效率，计算公式：转分化效率＝myhc阳性的肌管所含细胞核数量/总的细胞核数量。
100.测试结果见表1。
101.表1
[0102][0103][0104]
结果显示：由实施例1与实施例4-9的对比结果可知，本发明在诱导培养基中同时添加chir99021、forsklin和repsox，三种小分子化合物相互配合，实现了诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管，并显著促进了转分化效率的提升，此结果表明chir99021、forsklin和repsox在诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管上具有协同增效的功效。由实施例1与实施例10-11的对比结果可知，诱导培养基中添加bfgf和维生素c进一步促进了转分化效率的提高，说明bfgf和维生素c起到了辅助本发明的小分子化合物诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的作用。
[0105]
此外，由实施例1与实施例2-3的对比结果可知，三种小分子化合物的用量对转分化效率有一定的影响，用量过大或过小均会在一定程度上降低转分化效率，用量为2-5μm chir99021、10-50μm forsklin、10-50μm repsox时，转分化效率能得达到10％以上。
[0106]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种诱导羊成纤维细胞直接转分化为肌管的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公
开范围之内。
[0107]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0108]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。