高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法及其应用与流程

1.本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法及其应用。


背景技术：

2.单克隆抗体是指由单一细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。1974年首次由德国科学家kohler和英国科学家milstein成功将骨髓瘤细胞和产生抗体的b淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，并因此获得1984年诺贝尔生理学及医学奖。杂交瘤细胞既具有可产生只针对某一特定抗原决定簇的单克隆抗体的b淋巴细胞特性，同时也具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性。杂交瘤技术的建立开创了抗体制备的新方法。单克隆抗体广泛应用于纯化蛋白、生物体内示踪、肿瘤诊断分型、病原体及抗体的检测、细胞分化阶段的判断、肿瘤及病毒感染的治疗等领域，具有广阔的市场空间和应用价值。与兔源、人源单克隆抗体相比，鼠源单克隆抗体应用广泛、技术成熟、成本低、可长期大规模生产。所选用的balb/c小鼠品系单一，遗传背景清楚，因此可以长期获得稳定、一致的抗体。
3.目前传统的鼠源单克隆抗体制备方法主要是杂交瘤技术，但是传统的基于有限稀释与elisa的筛选方法对于阳性细胞的筛选非常复杂和低效。随后有专利报道可在骨髓瘤细胞和脾脏细胞融合后，先对杂交瘤细胞克隆进行特异性细胞染色，然后手工挑取特定细胞克隆从而获得特异性杂交瘤细胞克隆，这种方法相对于传统的基于有限稀释与elisa的方法，其筛选效率大幅提高，但其仍具有以下缺点：(1)融合细胞阳性率低：由于脾细胞中特异性浆细胞数量较少、脾细胞和骨髓瘤细胞融合后的阳性细胞比例低，因此长出的阳性克隆的比例少。(2)耗费细胞量多：使用培养板培养基等耗材多，由于特异性阳性浆细胞数量在脾细胞中的比例少，因此需要用尽量多的脾细胞和对应比例的sp2/0细胞来进行融合，耗费量大。(3)实验周期长，操作中易丢失阳性细胞株：融合后的杂交瘤细胞团先在荧光显微镜下观察，进行标记，之后再手动挑取。由于是手工挑取因此需要细胞克隆长的较大才能进行，因此需要的时间较长(14-28天)，且容易在挑取的过程中丢失阳性细胞团。


技术实现要素：

4.针对背景技术提出的问题，本发明的目的在于提出一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，能够能够快速、简便筛选分泌特异性抗体的浆细胞，将浆细胞直接和骨髓瘤细胞进行融合，便可形成分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，不仅能有效减少消耗的骨髓瘤细胞的数量，而且能够显著提高阳性细胞比例，准确率高，同时能大大缩短杂交瘤细胞的筛选时间，减少克隆化的次数，避免阳性细胞株的丢失。
5.本发明的另一目的在于提出一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法在制备鼠源单克隆抗体中应用，能显著缩短单克隆抗体制备周期。
6.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，包括以下步骤：
8.(1)将oleyl-peg-nhs与抗原偶联，得到oleyl-peg-nhs-抗原；
9.(2)将脾脏细胞清洗后，加入oleyl-peg-nhs-抗原，于37℃、5％co2的条件下进行孵育，然后弃上清，清洗脾脏细胞；
10.(3)将荧光物质标记的抗鼠二抗加入到步骤(2)处理好的脾脏细胞中，于37℃、5％co2的条件下进行孵育，然后弃上清，清洗脾脏细胞；
11.(4)将脾脏细胞通过流式细胞仪分选，分选出带荧光标记的细胞，即为分泌特异性抗体的浆细胞；
12.(5)将浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；
13.(6)将杂交瘤细胞按照步骤(2)和步骤(3)进行染色后，用单细胞挑取仪对具有强荧光的杂交瘤细胞进行挑取，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
14.进一步，在所述步骤(1)中，所述抗原为cdkn2a-p16蛋白或pedv-n蛋白。
15.进一步，在所述步骤(2)中，按96孔板计算，所述oleyl-peg-nhs-抗原的加入量为每孔添加200μg。
16.进一步，在所述步骤(5)中，所述浆细胞与所述骨髓瘤细胞进行融合时，浆细胞的细胞数和骨髓瘤细胞的细胞数的比例为1：5～1：10。
17.进一步，在所述步骤(3)中，所述荧光物质为异硫氰酸荧光、af647和别藻蓝蛋白中的任意一种。
18.进一步，在所述步骤(3)中，所述抗鼠二抗为羊抗鼠iggfc二抗。
19.进一步，所述步骤(2)中孵育的时间为30～180min；
20.所述步骤(3)中孵育的时间为30～180min。
21.进一步，所述步骤(2)和所述步骤(3)中分别使用磷酸盐缓冲液或1640基础培养基清洗脾脏细胞。
22.根据上述的高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法在制备鼠源单克隆抗体中应用。
23.上述技术方案具有以下有益效果：
24.1、本技术方案通过一种两亲性物质(oleyl-peg-nhs)结合流式分选和显微单细胞挑取仪，能够快速、简便筛选分泌特异性抗体的浆细胞，将能够分泌特异性抗体的浆细胞直接和骨髓瘤细胞进行融合，形成分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，不仅能有效减少消耗的骨髓瘤细胞的数量，而且能够显著提高阳性细胞比例，准确率95％以上，准确率高，同时能大大缩短杂交瘤细胞的筛选时间，减少克隆化的次数，避免阳性细胞株的丢失。
25.2、提高融合细胞阳性率，减少细胞耗费量，两亲性物质(oleyl-peg-nhs)能够锚定在细胞膜的磷脂双分子层上，再偶联抗原后，浆细胞所分泌的抗体可与偶联物中的抗原结合，再加入荧光二抗(即荧光物质标记的抗鼠二抗)与分泌抗体结合，即可通过流式细胞仪将带荧光的细胞分选出来，即为单个特异性浆细胞，通过流式细胞仪从脾细胞群中挑取出特异性浆细胞后，只将特异性浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合，融合后的阳性率大幅提高，同时大幅减少了脾脏细胞的使用量，同比大幅减少了骨髓瘤细胞的使用量；
26.3、缩短实验周期，降低实验要求，提高挑取成功率，通过显微单细胞挑取仪可直接获得分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤单细胞或小克隆团，细胞培养的时间可以大幅缩短，能显著缩短单克隆抗体制备周期，同时用单细胞挑取仪能够实现对阳性细胞的精细挑取，
降低对实验操作人员的要求，有效避免挑取失误。
附图说明
27.图1是本发明一个实施例的高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法的原理图；
28.图2是实施例1采用elisa法检测小鼠血清中抗体效价折线图；
29.图3为实施例1中抗原偶联复合物紫外可见分光光度计扫描鉴定图；
30.图4实施例1中使用单细胞挑取仪挑取单个分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞前后对比图。
具体实施方式
31.下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
32.一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，包括以下步骤：
33.(1)将oleyl-peg-nhs与抗原偶联，得到oleyl-peg-nhs-抗原；
34.(2)将脾脏细胞清洗后，加入oleyl-peg-nhs-抗原，于37℃、5％co2的条件下进行孵育，然后弃上清，清洗脾脏细胞；
35.(3)将荧光物质标记的抗鼠二抗加入到步骤(2)处理好的脾脏细胞中，于37℃、5％co2的条件下进行孵育，然后弃上清，清洗脾脏细胞；
36.(4)将脾脏细胞通过流式细胞仪分选，分选出带荧光标记的细胞，即为分泌特异性抗体的浆细胞；
37.(5)将浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；
38.(6)将杂交瘤细胞按照步骤(2)和步骤(3)进行染色后，用单细胞挑取仪对具有强荧光的杂交瘤细胞进行挑取，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
39.由于脾脏细胞中特异性浆细胞数量较少，造成所耗费的骨髓瘤细胞数量多，脾脏细胞和骨髓瘤细胞融合后的阳性细胞比例低，长出的阳性克隆的比例少，本技术方案通过一种两亲性物质(oleyl-peg-nhs)结合流式分选和显微单细胞挑取仪，能够快速、简便筛选分泌特异性抗体的浆细胞，将能够分泌特异性抗体的浆细胞直接和骨髓瘤细胞进行融合，形成分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，不仅能有效减少消耗的骨髓瘤细胞的数量，而且能够显著提高阳性细胞比例，准确率95％以上，准确率高，同时能大大缩短杂交瘤细胞的筛选时间，减少克隆化的次数，避免阳性细胞株的丢失。
40.值得说明的是，oleyl-peg-nhs是一种两亲性物质，其一端是亲脂性的，能够锚定在细胞膜的磷脂双分子层上，与细胞膜结合，另一端的peg聚合物是亲水性的，其末端连接的-coo-nhs是经nhs活化过的羧基，可以与抗原上的氨基相结合，把偶联的特定抗原偶联物加入到脾脏细胞，孵育后偶联物的一端连接到细胞膜上，偶联的抗原捕获浆细胞分泌的抗体从而实现对浆细胞的定位，洗去未结合的抗体，加入荧光物质标记的抗鼠二抗孵育，洗去未结合的抗鼠二抗，将孵育后的细胞通过流式细胞仪进行分选，筛选出含有荧光的细胞，即为分泌特异性抗体的浆细胞，将流式分选获得的浆细胞和骨髓瘤细胞融合后获得杂交瘤细胞，再对杂交瘤细胞进行染色，用单细胞挑取仪直接挑取强荧光的杂交瘤细胞，即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，本技术方案高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法的原理
图如附图1所示。本技术通过染色技术和流式细胞仪对脾脏细胞的分选能够有效筛选出特异性浆细胞，提高后续细胞融合的效率和阳性率，通过显微单细胞挑取仪在两周内就能筛选到能分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，能够有效缩短分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，同时能够有效避免传统筛选方法带来的失误的影响，避免阳性细胞株的丢失。
41.进一步是说明，采用本技术方案的方法进行筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞具有以下的优点和效果：
42.1、提高融合细胞阳性率，减少细胞耗费量：两亲性物质(oleyl-peg-nhs)能够锚定在细胞膜的磷脂双分子层上，再偶联抗原后，浆细胞所分泌的抗体可与偶联物中的抗原结合，再加入荧光二抗(即荧光物质标记的抗鼠二抗)与分泌抗体结合，即可通过流式细胞仪将带荧光的细胞分选出来，即为单个特异性浆细胞，通过流式细胞仪从脾细胞群中挑取出特异性浆细胞后，只将特异性浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合，融合后的阳性率大幅提高，同时大幅减少了脾脏细胞的使用量，同比大幅减少了骨髓瘤细胞的使用量；
43.(2)缩短实验周期，降低实验要求，提高挑取成功率：通过显微单细胞挑取仪可直接获得分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤单细胞或小克隆团，由于在最开始对特异性浆细胞进行了筛选，再进行细胞融合，所以无需再对杂交瘤细胞进行筛选，使得细胞培养的时间可以大幅缩短，能显著缩短单克隆抗体制备周期，同时用单细胞挑取仪能够实现对阳性细胞的精细挑取，降低对实验操作人员的要求，有效避免挑取失误。
44.具体来说，本技术方案获得脾脏细胞包括以下步骤：
45.(1)免疫balb/c小鼠，初次免疫小鼠时需将抗原和弗氏完全佐剂混合乳化，之后每次免疫将抗原和弗氏不完全佐剂混合乳化，冲刺免疫时选择无佐剂免疫。
46.(2)elisa间接法评估小鼠血清中抗体含量(如图2所示)。
47.(3)取小鼠脾脏，研磨过筛后获得脾脏细胞。
48.优选的，balb/c小鼠为4-6周雌性balb/c小鼠，在上述步骤(1)中免疫小鼠时抗原剂量优选为100μg/只，抗原与弗氏佐剂的体积比优选为1：1，冲刺免疫时抗原剂量优选为50μg/只；在步骤(3)中，研磨脾脏细胞时，选用200目细胞筛。
49.进一步的说明，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述抗原为cdkn2a-p16蛋白或pedv-n蛋白。
50.具体来说，步骤(1)中，将oleyl-peg-nhs与抗原偶联的方法可为常规的偶联方法，其中，当抗原是非完全抗原时，先将oleyl-peg-nhs与载体蛋白偶联，再与抗原偶联，因为非完全抗原单独存在时不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当与大分子蛋白质或非抗原性的载体交联或结合后可获得免疫原性，从而诱导免疫应答；当当抗原是完全抗原时，将oleyl-peg-nhs与抗原直接偶联即可。
51.进一步的说明，在所述步骤(2)中，按96孔板计算，所述oleyl-peg-nhs-抗原的加入量为每孔添加200μg。
52.具体来说，oleyl-peg-nhs-抗原的加入量为每孔添加200μg，的加入200μg能获得最佳效果，若加入量过多，会容易造成浪费；若加入量过少容易导致反应不充分。
53.进一步的说明，在所述步骤(5)中，所述浆细胞与所述骨髓瘤细胞进行融合时，浆细胞的细胞数和骨髓瘤细胞的细胞数的比例为1：5～1：10。
54.值得说明的是，当述浆细胞与所述骨髓瘤细胞进行融合时，细胞数比例为1：5～1：
10时，融合效率更高，更有利于浆细胞与骨髓瘤细胞融合形成分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，从而提高杂交瘤细胞的形成率，有利于后期高效制备鼠源单克隆抗体。
55.进一步的说明，在所述步骤(3)中，所述荧光物质为异硫氰酸荧光、af647和别藻蓝蛋白中的任意一种。
56.异硫氰酸荧光素，英文全称fluorescein isothiocyanate，简称fitc，具有高吸收率、优良的荧光量子产率和良好的水溶性等特点，能够作为为抗体和蛋白质荧光示踪剂，异硫氰酸荧光素的异硫氰酸基团可与蛋白的氨基末端或者伯胺反应，从而实现抗体，凝集素在内的蛋白标记。
57.af647全称为alexa fluor 647是一种明亮的远红色荧光染料，具有高荧光量子产率和高光稳定性的探针可以检测低丰度的生物结构，灵敏度高。alexa-fluor647染料分子可以在高摩尔比下附着到蛋白质上，而不会产生明显的自猝灭，从而导致更明亮的共轭物和更灵敏的检测。
58.别藻蓝蛋白(allophycocyanin,apc)，是从蓝绿藻中分离纯化的藻胆蛋白，用于生物学检测的超灵敏荧光染料。别藻蓝蛋白在较宽的ph范围内具有较宽的吸收光谱，比较容易选择合适的激发波长，从而得到高效荧光发射，且激发时有特异的荧光发射峰；且吸光度和荧光量子产率很高，荧光强而稳定，灵敏度高；同时别藻蓝蛋白是从纯天然海洋生物中提取得到的，无任何毒副作用，不含放射性，操作使用非常安全。
59.进一步的说明，在所述步骤(3)中，所述抗鼠二抗为羊抗鼠iggfc二抗使得说明的是，抗鼠二抗为羊抗鼠iggfc二抗能够避免假阳性。
60.进一步的说明，所述步骤(2)中孵育的时间为30～180min；
61.所述步骤(3)中孵育的时间为30～180min。
62.值得说明的是，步骤(2)中细胞孵育的时间会影响细胞表面的oleyl-peg4-nhs-抗原的数量和浆细胞分泌抗体的数量，均会影响筛选效果，若培养时间过短，会导致连接到细胞表面的oleyl-peg-nhs-抗原的数量过少，导致捕获分泌抗体不足，从而导致一些阳性细胞被漏选，造成假阴性；若培养时间过长，则造成分泌抗体量多，结合到非抗体分泌细胞，造成假阳性。
63.在步骤(4)的作用是为了等待荧光物质标记的抗鼠二抗与分泌的抗体结合，若培养的时间过短可能会导致结合数量少，容易造成假阴性；若培养的时间过长，会导致非特异性结合，造成假阳性筛选。
64.优选的，步骤(2)中孵育的时间为180min，步骤(3)中孵育的时间为120min。
65.进一步的说明，所述步骤(2)和所述步骤(3)中分别使用磷酸盐缓冲液或1640基础培养基清洗脾脏细胞。
66.根据上述的高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法在制备鼠源单克隆抗体中应用。
67.值得说明的是，将本技术方案中高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，用于制备鼠源单克隆抗体，由于本技术方案在最开始对特异性浆细胞进行了筛选，再进行细胞融合，所以无需再对杂交瘤细胞进行筛选，使得杂交瘤细胞培养的时间可以大幅缩短，能显著缩短单克隆抗体制备周期。
68.下面结合实施例进一步阐述本技术方案。
69.实施例1
70.一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，在本实施例筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞之前，需要先通过免疫小鼠来获得脾脏细胞，获得脾脏细胞包括以下步骤的方法如下：
71.①
免疫balb/c小鼠，初次免疫小鼠时需将cdkn2a-p16抗原和弗氏完全佐剂混合乳化，之后每次免疫将cdkn2a-p16抗原和弗氏不完全佐剂混合乳化；
72.②
采用elisa间接法评估小鼠血清中抗体含量；
73.③
取小鼠脾脏，研磨过筛后获得脾脏细胞。
74.通过上述方法获得脾脏细胞，采用以下方法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞：
75.(1)将oleyl-peg-nhs与抗原(cdkn2a-p16)偶联，得到oleyl-peg-nhs-抗原，其中，包括oleyl-peg-nhs与cdkn2a-p16蛋白的偶联，及oleyl-peg-nhs-cdkn2a-p16蛋白的鉴定两个步骤，具体操作方法如下：
76.oleyl-peg-nhs与cdkn2a-p16蛋白的偶联：
77.①
称取10mg oleyl-peg-nhs溶于1ml15mm ph7.4的pbs，得到10mg/ml原液；
78.②
将21.5mg cdkn2a-p16蛋白加入玻璃瓶中，加入1ml15mm ph7.4的pbs溶解，置于磁力搅拌器上搅拌；
79.③
将
①
中的原液缓慢加入上述玻璃瓶，使终体积为2.15ml，室温搅拌3小时，得到oleyl-peg-nhs-cdkn2a-p16蛋白溶液；
80.④
将
③
中获得的oleyl-peg-cdkn2a-p16蛋白溶液过滤除菌，置于4℃保存；
81.oleyl-peg-nhs-cdkn2a-p16蛋白的鉴定：通过紫外可见分光光度计扫描鉴定，通过观察不同物质的吸收峰的偏移来判断抗原偶联效果，由于cdkn2a-p16、oleyl-peg-nhs-cdkn2a-p16和oleyl-peg-nhs分子量有一定的差别，由图3可知oleyl-peg4000-nhs最大吸收峰在260nm，oleyl-peg4000-nhs-抗原最大吸收峰在276nm，抗原最大吸收峰在280nm，不同物质的最大吸收峰不一样，相对偶联前，各物质最大吸收峰发生了偏移，证明了oleyl-peg4000-nhs-抗原复合物偶联成功；
82.(2)将所分离出的脾脏细胞，接种于96孔板内，培养三天后，每孔加入200μg的oleyl-peg-nhs-抗原，于37℃、5％co2的条件下孵育180min，然后弃上清，将孵育好的脾脏细胞用1640基础培养基洗涤；
83.(3)将fitc标记的羊抗鼠iggfc加入到步骤(2)处理好的脾脏细胞中，于37℃、5％co2的条件下孵育120min，然后弃上清，清洗脾脏细胞；
84.(4)将步骤(3)所获得的已染色的脾脏细胞放入流式细胞仪，进行流式分选，分选出带荧光标记的细胞，即为分泌特异性抗体的浆细胞；
85.(5)将步骤(4)中获得的浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，操作方法如下：将骨髓瘤细胞和浆细胞的比例控制在1：5的比例混合，1000rpm离心8分钟，小心倒掉上清，并用无菌滤纸(吸水纸)吸净上清，准备三个计时器(90s，150s,4min30s)轻轻敲击离心管底部，保证细胞分散以便于融合(手指弹，或者用离心管敲击超净工作台)；开始加入1ml peg启动三个计时器，在60～90s的时间内均匀加完1ml peg(此时需要不停的旋转敲击离心管)；随后加入9ml 1640基础培养基，开始的1～2ml需要用1分钟/ml的速度加入(第二个计时器结束前)，随后的7ml需要在最后一个计时器结束计时前加完(保持细胞的摇晃状
态)；最后将细胞放在37℃中孵育10min后；1000rpm离心5分钟，加入5ml hat培养基(hat培养基为每500mlhat培养基中含有100μm次黄嘌呤、0.4μm氨基蝶呤、16μm胸腺嘧啶核苷)，然后稀释至100ml，将细胞悬液添加到96孔板中，每孔100ul，将培养板放入细胞培养箱培养，得到cdkn2a-p16杂交瘤细胞；
86.(6)将杂交瘤细胞按照步骤(2)和步骤(3)进行染色后，用单细胞挑取仪对具有强荧光的杂交瘤细胞进行挑取，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，操作方法如下：
87.①
在杂交瘤细胞培养3天后，再加入oleyl-peg-cdkn2a-p16孵育180min。之后用hat培养基洗涤，加入fitc-羊抗鼠iggfc孵育120min，之后用hat培养基洗涤；
88.②
挑取强荧光单个杂交瘤细胞：将染色后的杂交瘤细胞加入到6孔细胞培养板中，用单细胞挑取仪将具有强荧光的杂交瘤细胞收集至96孔细胞培养板中培养；
89.③
结果：将单细胞挑取仪所挑取出的带有荧光的细胞进行培养，经过elisa检测上清液，所挑取出的有荧光标记的单个杂交瘤细胞为即为能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，根据以下公式计算能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的准确率，通过计算得到准确率达到95％以上。
90.准确率＝能分泌抗体的细胞数/挑取的细胞数。
91.实施例2
92.一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，在本实施例筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞之前，需要先通过免疫小鼠来获得脾脏细胞，获得脾脏细胞包括以下步骤的方法如下：
93.①
免疫balb/c小鼠，初次免疫小鼠时需将pedv-n蛋白和弗氏完全佐剂混合乳化，之后每次免疫将pedv-n蛋白和弗氏不完全佐剂混合乳化；
94.②
采用elisa间接法评估小鼠血清中抗体含量；
95.③
取小鼠脾脏，研磨过筛后获得脾脏细胞。
96.通过上述方法获得脾脏细胞，采用以下方法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞：
97.(1)将oleyl-peg-nhs与抗原(pedvn蛋白)偶联，得到oleyl-peg-nhs-抗原，其中，包括oleyl-peg-nhs与pedv n蛋白的偶联，及oleyl-peg-nhs-pedv n蛋白的鉴定两个步骤，具体操作方法如下：
98.oleyl-peg-nhs与pedv n蛋白的偶联：
99.①
称取10mg oleyl-peg-nhs溶于1ml15mm ph7.4的pbs，得到10mg/ml原液；
100.②
将21.5mgpedvn蛋白加入玻璃瓶中，加入1ml15mm ph7.4的pbs溶解，置于磁力搅拌器上搅拌；
101.③
将
①
中的原液缓慢加入上述玻璃瓶，使终体积为2.15ml，室温搅拌3小时，得到oleyl-peg-nhs-pedv n溶液；
102.④
将
③
中获得的oleyl-peg-pedv n蛋白溶液过滤除菌，置于4℃保存；
103.oleyl-peg-nhs-pedv n蛋白的鉴定：通过紫外可见分光光度计扫描鉴定，通过观察不同物质的吸收峰的偏移来判断抗原偶联效果，由于pedv n蛋白、oleyl-peg-nhs-pedv n蛋白和oleyl-peg-nhs分子量有一定的差别，oleyl-peg4000-nhs最大吸收峰在260nm，oleyl-peg4000-nhs-抗原最大吸收峰在276nm，抗原最大吸收峰在280nm，不同物质的最大吸收峰不一样，相对偶联前，各物质最大吸收峰发生了偏移，证明了oleyl-peg4000-nhs-抗
原复合物偶联成功；
104.(2)将所分离出的脾脏细胞，接种于96孔板内，培养三天后，每孔加入200μg的oleyl-peg-nhs-抗原，于37℃、5％co2的条件下孵育180min，然后弃上清，将孵育好的脾脏细胞用1640基础培养基洗涤；
105.(3)将af647标记的羊抗鼠iggfc加入到步骤(2)处理好的脾脏细胞中，于37℃、5％co2的条件下孵育120min，然后弃上清，清洗脾脏细胞；
106.(4)将步骤(3)所获得的已染色的脾脏细胞放入流式细胞仪，进行流式分选，分选出带荧光标记的细胞，即为分泌特异性抗体的浆细胞；
107.(5)将步骤(4)中获得的浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，操作方法如下：将骨髓瘤细胞和浆细胞的比例控制1：10的比例混合，1000rpm离心8分钟，小心倒掉上清，并用无菌滤纸(吸水纸)吸净上清，准备三个计时器(90s，150s，4min30s)轻轻敲击离心管底部，保证细胞分散以便于融合(手指弹，或者用离心管敲击超净工作台)；开始加入1ml peg启动三个计时器，在60～90s的时间内均匀加完1ml peg(此时需要不停的旋转敲击离心管)；随后加入9ml 1640基础培养基，开始的1～2ml需要用1分钟/ml的速度加入(第二个计时器结束前)，随后的7ml需要在最后一个计时器结束计时前加完(保持细胞的摇晃状态)；最后将细胞放在37℃中孵育10min后；1000rpm离心5分钟，加入5ml hat培养基，然后稀释至100ml，将细胞悬液添加到96孔板中，每孔100ul，将培养板放入细胞培养箱培养，得到pedv n蛋白杂交瘤细胞；
108.(6)将杂交瘤细胞按照步骤(2)和步骤(3)进行染色后，用单细胞挑取仪对具有强荧光的杂交瘤细胞进行挑取，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，操作方法如下：
109.①
在杂交瘤细胞培养3天后，再加入oleyl-peg-pedv n孵育180min。之后用hat培养基洗涤，加入fitc-羊抗鼠iggfc孵育120min，之后用hat培养基洗涤；
110.②
挑取强荧光单个杂交瘤细胞：将染色后的杂交瘤细胞加入到6孔细胞培养板中，用单细胞挑取仪将具有强荧光的杂交瘤细胞收集至96孔细胞培养板中培养；
111.③
结果：将单细胞挑取仪所挑取出的带有荧光的细胞进行培养，经过elisa检测上清液，所挑取出的有荧光标记的单个杂交瘤细胞为即为能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，通过实施例中能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的准确率计算公式计算得到，准确率达到95％以上。
112.以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。