一株姜黄内生菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，涉及一株姜黄内生菌及其应用。


背景技术：

2.四氢姜黄素由姜黄素氢化而来，是姜黄素在体内的主要活性代谢产物
1.。大量的研究表明
[2-6]
：四氢姜黄素具有抗氧化、抗炎、调血脂、保护神经、抗肿瘤、抗黑色素沉积等药理活性。目前，四氢姜黄素主要通过钯碳
[7,8]
或铂-铁镍氢氧化物
[9]
催化加氢合成，然而这两种催化剂与氢气反应较为剧烈，易爆炸，并且价格也很昂贵。微生物转化法则具有区域选择性和立体选择性高、反应条件温和、操作简单、成本低廉和环境友好等优点，逐渐受到人们的关注
[10]
。张维宇等从土壤中分离出的pichia kudriavzevii zjph0802 strain能将姜黄素转化为四氢姜黄素
[11]
，刘彬等通过大肠杆菌过表达g6pdh也可实现四氢姜黄素的生物合成。但是，这些方法的产率并不高，可能是姜黄素本身具有抑菌活性所致。
[0003]
植物内生菌广泛存在于植物健康组织中，通过与宿主植物的相互作用，合成生物碱、皂苷、醌类、类黄酮、萜类化合物等代谢活性成分。1993年，stierle小组首次从短叶红豆杉中筛选获得1株代谢产紫杉醇的内生真菌-安德氏紫杉霉(taxom ycesandreanae)，被广泛应用于生物合成制药
[12]
。我们检测了姜黄根茎中四氢姜黄素的含量，发现以发芽的块茎中含量最高。shoji等
[13]
从姜黄根茎中也分离筛选到1株diaporthe sp菌可将姜黄素转化为四氢姜黄素，但产率很低。因此，我们针对不同时期、产地和部位的姜黄块茎筛选出1株姜黄内生菌，并通过正交优化培养基碳源和氮源，以形成稳定、高效生物转化四氢姜黄素的方法。
[0004]
参考文献
[0005]
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[8]郭文华,肖金霞,王晓莹,et al.一种四氢姜黄素的制备方法,cn104496779b[p/ol].2017-01-11].
[0013]
[9]陈亮,辛秀兰,危晴,et al.一种新的四氢姜黄素制备方法,cn111925284a[p/ol].2020-11-13].
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技术实现要素：

[0018]
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株姜黄内生菌debaryomyces sp.navl3-3。
[0019]
本发明的另一目的是提供该菌株的应用。
[0020]
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0021]
一种姜黄内生菌debaryomyces sp.navl3-3，与2022年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20221064。
[0022]
由所述的姜黄内生菌debaryomyces sp.navl3-3制备的菌剂。
[0023]
所述的姜黄内生菌debaryomyces sp.navl3-3或所述的菌剂在将姜黄素转化为四氢姜黄素中的应用。
[0024]
一种利用所述的姜黄内生菌debaryomyces sp.navl3-3转化姜黄素制备四氢姜黄素的培养基，所述的培养基以ph为7的pbs为基础，添加麦芽糖50-70g/l，玉米浆1-10g/l，硫酸锌0.1-1g/l，钾离子0.3-1.8g/l，姜黄素量50-100mg/l。
[0025]
作为本发明的一种优选,所述的培养基以pbs为基础，添加：麦芽糖55g/l，玉米浆4g/l，znso
4 0.5g/l，钾离子0.6g/l，姜黄素62.5mg/l。
[0026]
一种利用所述的姜黄内生菌debaryomyces sp.navl3-3转化姜黄素制备四氢姜黄素的方法，将所述的姜黄内生菌debaryomyces sp.navl3-3湿菌体接种于本发明所述的培养基进行发酵培养，接种菌量为40-50g/l，培养时间为20-40h，温度25-30℃，转数180-250rpm。
20221064。
[0041]
上游引物：5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgc-3’(its1)。
[0042]
下游引物：5
’‑
tcctcccgcttattgatatgc-3’(its4)。
[0043]
经过上述菌株鉴定，该姜黄内生菌的核苷酸序列seq id no:1所示。
[0044]
实施例3菌株的扩大培养方法
[0045]
取实施例1中已保藏在-80℃冰箱内的姜黄内生菌菌种，按照体积比1％的接种量活化菌种至100ml pdb液体培养基内，置于摇床内进行扩大培养，设置摇床温度为28℃、转速为180rpm，培养48h，再按照体积比1％的接种量活化菌种至1500ml pdb液体培养基内，置于摇床内进行扩大培养，设置摇床温度为28℃、转速为180rpm，培养48h，后将发酵培养液置于离心管内，使用冷冻离心机内进行离心，离心温度为4℃，转速为6000rpm，离心时间为2min，后去除上清液，收集菌株，接着加入30ml的无菌pbs液体，再置于冷冻离心机内离心，去除上清液，使残留的发酵培养液清洗去除，得到姜黄内生菌navl3-3湿菌体。
[0046]
实施例4内生菌转化姜黄素生成四氢姜黄素检验
[0047]
取1.5g navl3-3湿菌体悬浮于40ml磷酸缓冲液中，加入2.5mg姜黄素底物进行转化，28℃，200rpm，36h摇床中转化，反应结束后，离心分离菌体，取上清液，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压蒸馏去乙酸乙酯，残留物用色谱甲醇溶解。转化结束后，液相色谱-电喷雾电离三重四极杆质谱鉴定四氢姜黄素以及使用hplc超高效液相色谱法检测四氢姜黄的含量。
[0048]
超高液相色谱测定的条件是：使用c
18 beh色谱柱，洗脱系统为乙腈：0.5％乙酸＝11:9，柱温为30℃，流速为0.2ml/min，进液量为2μl；
[0049]
四氢姜黄素对照品的制备：精密称取四氢姜黄素对照品，加入适量甲醇使其溶解，配制成浓度为250mg/ml，125mg/ml，62.5mg/ml，31.25mg/ml的对照品溶液。
[0050]
将得到的对照品和供试品进行超高液相测定，即得到转化后四氢姜黄素的含量为30mg/l。
[0051]
液相色谱-电喷雾电离三重四极杆质谱样品通过uplc系统地c18柱进行(50mm
×
2.1mm，粒径3μm)分离。柱温为25℃，用乙腈和0.1％乙酸溶液(80：20，v/v)，流速为0.3ml/min等速洗脱，每次样品运行时间为3.0min，进针量为10μl。质谱分析的参数如下：喷雾电压，4500v；蒸发器温度，400℃；护套气体压力：35psi；辅助气体压力：30psi；毛细管温度：350℃；碰撞气体压力：1.5mtorr；四氢姜黄素的碰撞能量为32ev。每个分析物的扫描时间设置为0.3s。数据采集由thermo mrm of 1channel es+thc 1.27e5执行。四氢姜黄素标品的质谱峰图和debaryomyces prosopidis发酵产物质谱鉴定结果见图1。
[0052]
实施例5培养基优化及正交实验
[0053]
步骤一：最适碳源、氮源、金属离子的筛选
[0054]
分别以8种碳源50g/l(葡萄糖，蔗糖，乳酸，柠檬酸，醋酸钠，甘油，乳糖，麦芽浸粉)，ph为7的pbs为发酵培养基，加入姜黄素62.5mg/l，接种菌量为40g/l，培养时间为36h，温度28℃，转数200rpm。分别以6种氮源4g/l(尿素，硫酸铵，胰蛋白胨，酵母粉，牛肉膏，玉米浆)，ph为7的pbs为发酵培养基，加入姜黄素62.5mg/l，接种菌量为40g/l，培养时间为36h，温度28℃，转数200rpm，每个处理重复三次。根据发酵转化出来的四氢姜黄素的，结果显示最适的碳源为麦芽浸粉，最佳氮源为玉米浆。
[0055]
步骤二：金属离子的筛选
[0056]
在步骤一的碳源筛选结果后，以麦芽糖20g/l，pbs(ph 7.0)为基础发酵培养基，加入姜黄素62.5mg/l，接种菌量为40g/l，在36h，温度28℃，转数200rpm的环境下进行发酵。选择8种0.5g/l无机离子(al(so4)3、znso4、cacl2、mnso4、cucl2、cocl2、feso4、mgso4和kcl)分别加入发酵培养基中，每个处理重复三次，根据发酵转化出来结果显示最佳金属离子为钾离子与锌离子。
[0057]
步骤三：碳源，氮源，金属离子最佳浓度筛选
[0058]
以pbs(ph 7.0)为基础发酵培养基，在接种菌量为40g/l，培养时间为36h，温度28℃，转数200rpm的发酵情况下。麦芽浸粉，玉米浆，锌离子，钾离子作为研究对象，按正交设计表l9(3
4)
优化培养基中麦芽浸粉、玉米浆、kcl、znso4的浓度。因素水平见表1，实验设计见表2所示，每组设3个平行样。
[0059]
由表2极差分析可得，麦芽浸粉浓度的极差最大，是影响四氢姜黄素的主要因素，玉米浆和钾离子是较主要因素，排列顺序为：麦芽浸粉》玉米浆》锌离子》钾离子，四因素最佳配比为a2b1c2d3。
[0060]
表1正交因素水平表
[0061][0062]
表2正交试验l9(34)结果
[0063][0064][0065]
步骤五 最适菌量筛选
[0066]
取一定量的湿菌，将其接种含有麦芽浸粉55g/l、玉米浆浓度4g/l、锌离子浓度0.5g/l、钾离子浓度0.6g/l发酵培养基中，使湿菌终浓度分别为20g/l，30g/l，35g/l，40g/l，45g/l，50g/l，60g/l，70g/l。在pbs(ph 7.0)温度28℃，转数200rpm的环境中进行转化，每个处理重复三次。根据发酵转化出来的四氢姜黄素的量判断45g/l菌量为最适菌量。
[0067]
步骤六最适姜黄素的量的筛选
[0068]
以麦芽浸粉55g/l、玉米浆浓度4g/l、锌离子浓度0.5g/l、钾离子浓度0.6g/l，在ph为7的pbs为发酵培养基，加入45g/l的湿菌体，取一定量的姜黄素，将50mg/l，62.5mg/l，87.5mg/l，112.5mg/l，137.5mg/l，250mg/l，500mg/l，1000mg/l加入麦芽浸粉55g/l、玉米浆浓度4g/l、锌离子浓度0.5g/l、钾离子浓度0.6g/l的培养基中，在pbs(ph 7.0)温度28℃，培养36h，转数200rpm，筛选最适姜黄素的量，每个处理重复三次。根据发酵转化出来的四氢姜黄素的量最适姜黄素的量为62.5mg/l。
[0069]
步骤七最适发酵时间的筛选
[0070]
以麦芽浸粉55g/l、玉米浆浓度4g/l、锌离子浓度0.5g/l、钾离子浓度0.6g/l，在
pbs(ph 7.0)发酵培养基，加入62.5mg/l的姜黄素，在温度28℃，转数200rpm环境分别培养24h、30h、36h、48h、60h、72h，筛选最适的发酵时间。根据发酵转化出来的四氢姜黄素的量选择最适的发酵时间为30h，最终转化率达到53％。