一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法与流程

本发明涉及体外核酸诊断，具体而言，涉及一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法。

背景技术：

1、脊髓性肌萎缩症(sma)是一种常染色体隐性遗传病，在人群中的携带率为1/40-1/50，患病率约为1/6000-1/10000，在致死性常染色体隐性遗传病中排第2位，目前针对此病还没有有效的治疗手段。研究表明这种疾病主要由位于5q11.2-q13.3上的运动神经元存活(smn)基因发生缺失或突变所致，并且其中占95％以上由第7号外显子和/或第8号外显子发生大片段缺失，导致smn蛋白无法正常表达，运动神经元凋亡，神经系统无法控制肌肉从而患病。

2、根据临床症状和发病年龄，可将脊髓性肌萎缩症(sma)分为4类，其中i-ⅲ型又称为儿童型，i型患者最严重，通常活不过两岁，ii型患者通常在1岁内起病，ⅲ型一般在青春期前发病，ⅳ型一般可活到成年，并且预后良好。

3、人运动神经元存活基因(smn)包括端粒端的运动神经元存活基因1(smn1)和着丝粒端的运动神经元存活基因2(smn2)，两个基因均包含8个外显子，并且smn1与smn2高度同源，仅有几个碱基的不同，导致sma的主要原因是smn1基因存在缺陷，而smn2基因主要与sma临床症状的轻重有关。通常正常人每个细胞含有2个拷贝的smn1基因，而smn2基因拷贝数可以为0至多个，携带者因其中一个smn1基因发生突变，从而只有1个拷贝正常的smn1基因，患者则两个smn1基因均发生了突变，无正常的smn1基因。smn2拷贝数越多，临床症状越轻。

4、目前临床上用于检测smn1基因拷贝数的方法主要有多重连接探针扩增技术(mlpa)、变性高效液相色谱法(dhplc)技术、限制性片段长度多态性分析聚合酶链式反应技术(pcr-rflp)、单链构象多态性聚合酶链反应(pcr-sscp)、荧光定量pcr技术。

5、其中，多重连接探针扩增技术由于smn1与smn2基因高度相似，该方法可准确测定出smn1与smn2基因的拷贝数，但操作复杂，并且需要专门的仪器，成本较高，不适于大规模测定；变性高效液相色谱法(dhplc)技术通量大，精确度高，但同样受仪器的限制；限制性片段长度多态性分析聚合酶链式反应技术(pcr-rflp)、单链构象多态性聚合酶链反应(pcr-sscp)可用于smn1基因7号外显子纯合缺失患者的定性分析，但不能检测杂合缺失型的携带者；这些方法大多比较繁杂且效果不佳，急需开发一种简便快捷、准确度高、特异性好的检测方法。

6、荧光定量pcr技术是由美国applied biosystems公司推出的一种实验技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行定量或定性分析。与常规pcr相比，荧光定量pcr技术具有灵敏度更高、特异性更强、自动化程度高等特点，能有效解决pcr产物的污染，在临床上广泛应用于微生物检测、病原体检测及基因分型等领域。

7、目前基于荧光定量pcr技术平台开发的基因多态性检测的试剂盒主要应用以下3种方法：

8、高分辨率溶解曲线分析技术(high resolution melting analysis，hrm)：hrm利用不同长度或不同碱基组成的dna序列熔解曲线不同的原理，在pcr后直接运行高分辨溶解就可完成对样品多态性分析。该方法无需序列特异性探针，也不受突变碱基位点与类型的局限，操作简单，无需pcr后续操作，灵敏度高，速度快，结果准确。但该方法是基于荧光染料实现，特异性不高，且对仪器设备的要求较高，目前在临床检测试剂盒上应用较少。

9、taqman探针法：是一种高度特异的荧光pcr技术，其核心是利用taq酶的外切酶活性，水解5’端标记有荧光报告基团的特异探针，释放荧光信号，通过荧光定量pcr仪捕捉信号实现pcr反应的实时监控，完成基因多态性检测分析。该方法需要设计特异性的引物探针识别不同类型序列，应用荧光定量pcr仪即可完成对样品基因型的判断，操作简单，灵敏度高，特异性强，在临床检测试剂盒上广泛应用。

10、扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，arms)：arms又名等位基因特异pcr(allele specific pcr,as-pcr)。其利用taq dna聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，pcr引物的3'端末位碱基必须与其模板dna互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知碱基设计适当的引物以检测出不同基因多态性。该法在设计引物时，在引物3'端设计一错配碱基，一个与野生dna互补，一个与突变dna互补，使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增产生的pcr产物可以通过凝胶电泳或是实时荧光定量pcr(real-time pcr)测定进行分析。基于荧光定量pcr技术的arms-pcr操作简单，特异性和灵敏性高，重复性好，在临床检测试剂盒上广泛应用，是目前的主流检测技术。

11、由于smn2基因与smn1基因高度同源，仅有5个碱基的差异，smn2基因会对smn1基因的检测产生强烈的干扰，利用常规的荧光pcr方法可能很难区分出样本中的smn1基因与smn2基因，目前市面上利用荧光pcr技术检测smn1基因时，大多都是同时对smn1基因和smn2基因分别设计引物和探针，这大大增加了检测成本和检测工作。

12、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法以解决上述技术问题。本发明利用荧光定量pcr技术实现对人运动神经元存活基因1(smn1)基因的7号外显子和8号外显子拷贝数情况进行准确测定。发明人采用taqman探针法和扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，arms)相结合的方式，仅对smn1基因设计对应的特异引物和探针，在smn2基因存在的样本中能准确扩增smn1基因而几乎不扩增smn2基因，同时对于极少数具有较多拷贝smn2基因的样本，在检测smn1基因时依然能准确检出，结果基本不受smn2基因干扰，实现了在不检测smn2基因的情况下准确检测smn1基因。

2、本发明是这样实现的：

3、本发明提供了一种用于人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物，其包括：

4、用于检测smn1基因第7外显子的第一引物探针组合物；其核苷酸序列依次为：seqid no.1、seq id no.2和seq id no.3所示；

5、用于检测smn1基因第8外显子的第二引物探针组合物；其核苷酸序列依次为：seqid no.4、seq id no.5、seq id no.6所示；

6、用于检测icon基因的第三引物探针组合物，其核苷酸序列依次为：seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9所示。

7、具体序列如下：

8、icon-f：cgcaatacctccggattcc，seq id no.7；

9、icon-r：tccgcagaggcactgagtt，seq id no.8；

10、icon-p：aacaggtcgctgcatggctggaa，seq id no.9；

11、smn1-e7-f：tccttccttctttttgattttgtccg，seq id no.1；

12、smn1-e7-r：tgtgaaacaaaatgctttttaacatcc，seq id no.2；

13、smn1-e7-p：acagggtttcagacaa，seq id no.3；

14、smn1-e8-f：cctcccacccccagcc，seq id no.4；

15、smn1-e8-r：aagttatgtaataaccaaatgcaatgtga，seq id no.5；

16、smn1-e8-p：cagtcttttacagatggtttt，seq id no.6。

17、上述第一引物探针组合物的检测引物的设计方式采用引物区分与探针区分结合的方式，不仅可提高第7外显子(即e7)反应靶标的扩增效率，还增强了体系识别smn1与smn2基因的能力。第二引物探针组合物的检测引物的设计方式为采用引物区分的方式。

18、在引物设计时，发明人结合taqman探针法和扩增阻滞突变系统(amplificationrefractory mutation system，arms)相结合的方式，仅对smn1基因设计对应的特异引物和探针，在smn2基因存在的样本中能准确扩增smn1基因而几乎不扩增smn2基因，同时对于极少数具有较多拷贝smn2基因的样本，在检测smn1基因时依然能准确检出，结果基本不受smn2基因干扰，实现了在不检测smn2基因的情况下准确检测smn1基因。

19、采用taqman探针法和扩增阻滞突变系统相结合的方式，既克服了单独使用taqman探针法扩增效率比较低的劣势，又克服了单独使用扩增阻滞突变系统区分smn1和smn2的效果较差的问题。经发明人验证，本发明提供的引物探针组合物具有较高的扩增效率，能够很好的区分smn1基因和smn2基因。

20、本发明还提供了一种试剂，其包括上述的用于人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物。

21、该试剂的剂型包括不限于冻干制剂、液体制剂。

22、在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂中引物探针组合物的工作浓度为100-300nmol/l。

23、经过发明人筛选优化，发现引物探针组合物采用上述的工作浓度可以确保smn1基因的扩增效率和icon基因的扩增效率一致，从而避免由于扩增效率不一致带来ct差值误差导致拷贝数误判。

24、例如引物探针组合物的工作浓度为100nmol/l，120nmol/l，150nmol/l,180nmol/l，200nmol/l，220nmol/l，250nmol/l或300nmol/l。

25、在一种可选的实施方式中，试剂中引物探针组合物的工作浓度为150-300nmol/l。在一种可选的实施方式中，试剂中引物探针组合物的工作浓度为200nmol/l。当引物探针组合浓度在200nm时得到的荧光扩增曲线灵敏度和特异性较佳、且荧光扩增曲线较稳定。

26、在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂中mg2+的浓度为1-5mm。发明人为了进一步提高增强pcr扩增效率，特设置在试剂中加入较高的浓度的镁离子。发明人发现，高浓度的镁离子浓度可以增强体系的稳定性以及耐受干扰的能力。

27、在一种可选的实施方式中，mg2+的浓度为3-5mm。例如选自3mm、4mm、4.5mm或5mm。

28、当镁离子浓度在4mm时得到的荧光扩增曲线灵敏度和特异性较佳、且荧光扩增曲线较稳定。

29、在一种可选的实施方式中，试剂还含有buffer，buffer包括：15-75mm tris、0-60mm硫酸铵、0-60mm氯化钾、0-1mg/ml bsa、0.5-1mol/l甜菜碱、0.5-2％dmso、1-5％甘油和水。水例如选自去离子水。上述buffer组成有助于提高试剂的稳定性和批间可重复性。

30、在一种可选的实施方式中，试剂还含有dntps和dutp，优选的比例为datp：dutp：dctp：dgtp＝1:2:1:1。

31、在一种可选的实施方式中，试剂中添加有参比染料。参比染料例如选自rox，可有效消除仪器孔间差异及其它荧光背景干扰，确保体系更稳定。

32、在其他实施方式中，参比染料可以选自hex、fam、5-fam、6-fam、tet、cf532、joe、tamra、rox、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、texas red、ned、alexa flour、tet、quasar670和vic等。

33、本发明还提供了一种试剂盒以便于对人运动神经元存活基因拷贝数进行定量检测，其包括上述的用于人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物或上述的试剂。

34、在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括smn1基因0拷贝数质控品、smn1基因2拷贝数质控品和空白对照。

35、空白对照可用于稀释质控品，也可同时作为空白对照。例如选自10mm ph8.0的tris-hcl。

36、例如针对smn1基因2拷贝数质控品使用空白对照进行浓度稀释，稀释3个浓度梯度，按照稀释1倍、稀释5倍和稀释25倍制备不同浓度梯度的smn1基因2拷贝数质控品。

37、例如针对smn1基因2拷贝数质控品使用空白对照进行浓度稀释，稀释3个浓度梯度，按照稀释1倍、稀释2倍和稀释4倍制备不同浓度梯度的smn1基因2拷贝数质控品。在上述3个稀释梯度下，目的基因与内标基因荧光信号线性较好。

38、在试剂盒中设置smn1基因0拷贝数质控品和smn1基因2拷贝数质控品，主要用于消除不同仪器、不同操作人员及不同批次试剂等因素造成的结果差异，保证结果的准确性。

39、在一种可选的实施方式中，试剂盒还包括酶混合液和buffer。

40、在本发明应用较佳的实施方式中，上述buffer包括：15-75mm tris、0-60mm硫酸铵、0-60mm氯化钾、0-1mg/ml bsa、0.5-1mol/l甜菜碱、0.5-2％dmso、1-5％甘油和水。试剂盒中各组分的形式也是经过多次优化调整的结果，目前的buffer耐受冻融的能力最强，能保证试剂在运输和使用过程中的稳定性。

41、在本发明应用较佳的实施方式中，上述酶混合液中包含热启动taq酶与ung酶，其中热启动taq酶具体为anstart taq dna polymerase酶。酶混合液中使用ung酶的目的在于消除环境中扩增产物的污染，防止对实验结果产生干扰和误判。

42、用于人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物在制备试剂或试剂盒中的应用。

43、本发明还提供了一种用于对人运动神经元拷贝数定量的系统，其包括：

44、上述的试剂盒、第一装置和第二装置，第一装置能够采用试剂盒对待测dna样本、质控品及空白对照分别进行实时荧光定量pcr检测，得到ct值数据；

45、第二装置包括：数据输入模块、数据运算模块和结论输出模块；

46、数据输入模块被配置为输入第一装置所得的ct值数据；

47、数据运算模块被配置为接收来自数据输入模块的ct值数据，对ct值数据进行计算，得到待测dna样本的smn1基因的δδct值；

48、结论输出模块被配置为接收来自数据运算模块的运算结果，根据待测dna样本的smn1基因的δδct值，输出待测dna样本含有多少个smn1基因拷贝的结论。

49、结论输出模块，对于smn1基因，按照如下标准输出结论：

50、在分析之前，需满足下列要求方可进行下一步的分析：空白对照孔未出现荧光信号或ct值≥35；smn1基因2拷贝数质控品最小浓度梯度孔目的基因与内标基因的ct值之差≤30；待测dna样本内标基因的ct值≤30；所稀释的三个浓度梯度的smn1基因2拷贝数质控品各梯度间目的基因与内标基因荧光信号线性相关系数需>0.99。

51、在满足上述条件后：分别计算三个浓度梯度smn1基因2拷贝数质控品目的基因与内标基因的ct值之差，并计算平均值，记为δct1。

52、计算待测dna样本目的基因与内标基因的ct值之差，记为δct2。

53、计算δδct，δδct＝δct2-δct1。

54、对于7号外显子，当目的基因无扩增或δδct>1.4时，输出样本中smn1基因7号外显子为0个拷贝。

55、对于7号外显子，当0.3≤δδct≤1.4时，输出样本中smn1基因7号外显子为1个拷贝。

56、对于7号外显子，δδct≤0时，输出样本中smn1基因7号外显子为2个拷贝。

57、对于8号外显子，当目的基因无扩增或δδct>1.6时，输出样本中smn1基因7号外显子为0个拷贝。

58、对于8号外显子，0.6≤δδct≤1.6时，输出样本中smn1基因8号外显子为1个拷贝。

59、对于8号外显子，δδct≤0.2时，输出样本中smn1基因8号外显子为2个拷贝。

60、本发明还提供了一种人运动神经元拷贝数定量的方法，该方法以非疾病的诊断为目的，其包括使用上述的用于人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、上述的试剂或上述的试剂盒对待测样本进行pcr，根据smn1基因第7外显子与icon基因的ct值之差以及smn1基因第8外显子与icon基因的ct值之差确定拷贝数。

61、结果分析方法如下：

62、空白对照在所有通道均未出现荧光信号或ct值≥35，可继续进行检测结果的分析，否则提示环境存在污染，需对实验环境进行消毒清洁后再重新检测。

63、smn1基因2拷贝数质控品三个浓度梯度中最小浓度梯度孔目的基因与内标基因需满足ct值≤30，待测样本的内标基因需满足ct值≤30。

64、smn1基因2拷贝数质控品稀释的三个浓度梯度间目的基因与内标基因荧光信号线性相关系数需>0.99。

65、smn1基因0拷贝数质控品检测结果应为缺失，即目的基因无荧光信号。

66、分别计算三个浓度梯度smn1基因2拷贝数质控品目的基因与内标基因的ct值之差，并计算平均值，记为δct1。

67、计算样本目的基因与内标基因的ct值之差，记为δct2。

68、计算δδct，δδct＝δct2-δct1。

69、对于7号外显子，当目的基因无扩增或δδct>1.4时，样本中smn1基因7号外显子为0个拷贝。

70、对于7号外显子，0.3≤δδct≤1.4时，样本中smn1基因7号外显子为1个拷贝。

71、对于7号外显子，δδct≤0时，样本中smn1基因7号外显子为2个拷贝。

72、对于8号外显子，当目的基因无扩增或δδct>1.6时，样本中smn1基因7号外显子为0个拷贝。

73、对于8号外显子，0.6≤δδct≤1.6时，样本中smn1基因8号外显子为1个拷贝。

74、对于8号外显子，δδct≤0.2时，样本中smn1基因8号外显子为2个拷贝。

75、本发明具有以下有益效果：

76、(1)与现有技术相比，本发明提供的引物探针组合物及试剂盒，只需检测smn1基因，不用额外设计引物探针检测smn2基因。在保证准确性的情况下缩减了成本。

77、(2)本发明提供的检测方法为taqman探针法和扩增阻滞突变系统(amplificationrefractory mutation system，arms)相结合的方式，既克服了单独使用taqman探针法扩增效率比较低的劣势，又克服了单独使用扩增阻滞突变系统区分smn1和smn2的效果较差的问题。两者相结合即保证了扩增效率也能增强smn1基因和smn2基因的区分能力。

78、(3)在体系中引入了内标系统，采用相对定量的结果判读方式，为保证结果的准确性，对smn1基因和内标基因的扩增引物的扩增效率进行了测定，以确保两者的扩增效率一致。

79、(4)本发明提供的试剂盒能更好的适应温度的变化，保证试剂的稳定性。本发明提供的试剂盒具有检测时间短，操作简单，准确性高，重复性好等优点，对于临床筛查sma患儿，降低患儿的出生率方面具有重要意义。