核酸提取试剂、试剂盒及其应用，以及核酸提取方法

本发明涉及生物，尤其涉及核酸提取试剂、试剂盒及其应用，以及核酸提取方法。

背景技术：

1、感染是威胁人类健康的重要因素之一，可产生产生不同的临床症状甚至危及生命。病原微生物鉴定是感染类疾病的诊断治疗中不可缺少的重要环节。由于传统金标准-病原微生物培养的耗时长，鉴定困难等弊端，宏基因组高通量测序技术自2014年首例用于诊断中枢神经系统钩体病患者以来逐步用于临床。血液标本是该技术的重要应用领域，为解决临床疑难感染患者的诊断难题提供了有效的解决方案。目前血液样本的ngs检测与组织、痰液等不同，其主要是检测血浆中，长度约为200bp的游离核酸，即cfdna。然而白细胞的吞噬并不能破坏掉结核杆菌、伤寒杆菌、产单核李斯特菌等细胞壁比较坚韧的细菌，因而这些菌会在白细胞内生长繁殖形成胞内菌，并随之扩散到其他部位。因此必须充分全面地提取血浆和血细胞中全部病原菌的dna才有助于全面的诊断疾病。

2、与此同时，生物微环境的改变、全球抗生素滥用等原因，导致了在临床环境中，耐药菌的出现愈发频繁，每年仅美国就有200万人感染耐药细菌，与敏感细菌引起的感染相比，耐药细菌感染缺乏可用的治疗方案，并极大地增加了发病率和死亡率。对人类、动物和环境样本的大规模比较研究、从而了解抗微生物药物耐药性基因的全球分布和耐多药细菌的传播显得尤为重要。测序技术的兴盛极大地补充了原有传统的基于培养的临床和监测方法，并为可培养或不可培养细菌的快速、灵敏的耐药测定提供了机会。但是目前主流的二代平台的短读长测序技术使得组装耐药基因这项工作需要消耗大量的计算资源，而且很难跨越重复区域或者复杂区域，容易造成基因片段组装的错误，误判基因坐在位置。新的测序技术，例如长读长测序技术就可以使长达几千bp甚至几万bp的序列直接读取，在研究纯培养细菌和宏基因组学样本中的抗菌素耐药性方面有很多优势。长度长测序可大大降低纯培养细菌和宏基因组学样本序列组装的复杂性，甚至可提供完整的细菌基因组。而这往往需要短、长测序片段的结合，方可有更加深入的解释。

3、综上所述，血流感染诊断，需要综合血浆及血细胞，集鉴定和耐药等多重维度进行综合诊疗。而从复杂多样的生物样本中迅速有效地分离和提取所需要的基因组核酸，作为遗传信息的携带者，无论是进行核酸结构还是功能研究都显得尤为重要。目前三代测序平台的兴旺发展使的部分平台(例如ont)已经可以同时测序20bp～2mbp长度的reads，同时满足对病原游离核酸的鉴定及耐药基因全长认知，甚至可以更完整获得新病原基因组的、达到人类遗传病与宏基因组的共检测目的。那么一种针对全血的，新型的提取方案，将短至200bp的cfdna，乃至长达2m级别的核酸一网打尽的提取方案，就显得尤为重要。

4、然而现在已知的技术方法中，针对血流感染样本没有一套综合的解决方案可以一网打尽跨度高达4个数量级的核酸。针对该类样本一般方法使用机械破壁法破坏细菌细胞壁，随后用酚氯仿等方法进行提取核酸提取，核酸片段在几百bp～40kbp不等。并最终使用磁珠纯化或者过吸附柱的方案进行杂质去除。由于经历的机械剪切过程较多，该类方法提取的核酸的完整度在23kb～40kb左右。提取流程中酚氯仿的引入也非常容易导致纯度不达标，无论是长度还是纯度均无法更好地满足上述基于长片段测序平台的血流感染的诊断需求。

5、因此，寻找一种纯度高、核酸片段长度跨度较高的核酸提取方法至关重要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了核酸提取试剂、试剂盒及其应用，以及核酸提取方法。本发明提供了一种针对血流感染病原菌的长短片段共提取试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒的效果可以达到：短至100bp左右的cfdna，直到长至高于2mb的病原菌gdna在同一提取管中共同提取，实现了长度跨度极大的长短片段共同提取，比现有只能分相提取的方案节省一半的时间及样本量，且因操作简便而可减少污染的可能。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了核酸提取试剂，包括：抗凝剂、csb、lmp、红细胞裂解液、白细胞裂解液、溶菌酶、蛋白酶k、rnase、溶胶酶和透析缓冲液。

4、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶以溶菌酶溶液的形式添加，所述溶菌酶溶液包括：溶菌酶、溶葡球菌酶和tris-hcl缓冲液。

5、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶的酶活≥400000u/ml，所述溶葡球菌酶的酶活≥500u/mg。

6、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述tris-hcl缓冲液的ph为7.2。

7、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶溶液中所述溶剂酶的体积为100～200μl；所述溶葡球菌酶的体积为50～150μl；所述tris-hcl缓冲液的体积为10ml。

8、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶溶液中所述溶剂酶的体积为100μl；所述溶葡球菌酶的体积为50μl；所述tris-hcl缓冲液的体积为10ml。

9、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶溶液中所述溶剂酶的体积为150μl；所述溶葡球菌酶的体积为100μl；所述tris-hcl缓冲液的体积为10ml。

10、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶溶液中所述溶剂酶的体积为200μl；所述溶葡球菌酶的体积为150μl；所述tris-hcl缓冲液的体积为10ml。

11、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述透析缓冲液包括：kcl、edta、tris-hcl、cacl2、mgcl2、四盐酸精胺和三盐酸精胺。

12、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述透析缓冲液中所述kcl的终浓度为10mm；所述edta的终浓度为5mm；所述tris-hcl的终浓度为10mm；所述cacl2的终浓度为1mm；所述mgcl2的终浓度位0.5mm。

13、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述四盐酸精胺或所述三盐酸精胺的的终浓度为1～4mm。

14、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述四盐酸精胺的终浓度为1mm；所述三盐酸精胺的终浓度为1mm。

15、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述四盐酸精胺的终浓度为2mm；所述三盐酸精胺的终浓度为2mm。

16、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述四盐酸精胺的终浓度为4mm；所述三盐酸精胺的终浓度为4mm。

17、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述抗凝剂包括edta，所述edta的终浓度为0.1m，体积为10μl。

18、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述csb体积为0.3ml；所述csb包括：100mmtris-hcl和100mmedta。

19、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述lmp的质量为10mg。

20、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中，所述白细胞裂解液的体积为800μl。

21、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述蛋白酶k以蛋白酶k溶液的形式添加，所述蛋白酶k溶液包括：蛋白酶k和ph为8.0的te缓冲液；所述te缓冲液包括：10mmtris-hcl和1mmedta。

22、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述rnase以rnase溶液的形式添加，所述rnase溶液包括：rna酶和ph为8.0的te缓冲液；所述te缓冲液包括：10mmtris-hcl和1mmedta。

23、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶胶酶的体积为4μl。

24、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中还包括ph为8.0的te缓冲液。

25、在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中还包括pbs缓冲液或ph为8.0的washbuffer；所述washbuffer包括：10mmtris-hcl和15mm edta。

26、本发明还提供了核酸提取试剂盒，包括上述的核酸提取试剂以及其他可接受的助剂或载体。

27、本发明还提供了核酸的提取方法，以上述核酸提取试剂或上述核酸提取试剂盒与待测样本混合。

28、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法中所述混合包括:

29、s1：取所述待测样本与所述抗凝剂混合，第一离心，获得血浆和血细胞；

30、s2：取所述血细胞与所述红细胞裂解液混合，第二离心，收集沉淀，与所述白细胞裂解液混合，第三离心，收集沉淀，获得所述细胞液；

31、s3：取所述血浆、所述csb、所述细胞液和所述lmp混合，凝固后，与所述溶菌酶溶液混合后，再与所述蛋白酶k混合，获得凝胶块；

32、s4：取所述凝胶块与te缓冲液混合后，与所述rnase混合，再与所述溶胶酶混合，第四离心后，获得dna混合液；

33、s5：取所述dna混合液与所述透析缓冲液混合，透析后，获得核酸分子。

34、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s1中所述第一离心的转速为1000g，时间为5min。

35、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s2中所述血细胞与所述红细胞裂解液的体积比为1:4。

36、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s2中所述第二离心的转速为3000rpm，时间为5min。

37、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s2中所述第三离心的转速为12000rpm，时间为5min。

38、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s3中所述血浆、所述csb、所述细胞液和所述lmp混合的温度为43℃。

39、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s3中所述与所述溶菌酶缓冲液混合的温度为37℃，时间为1h。

40、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s3中所述再与所述蛋白酶k混合的温度为50℃，时间为2h。

41、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s3中所述再与所述蛋白酶k混合后，所述获得凝胶块前还包括清洗的步骤；所述清洗采用ph为8.0的washbuffer；所述washbuffer包括：10mmtris-hcl和15mmedta。

42、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s4中所述取所述凝胶块与te缓冲液混合的时间为15min，温度为20～25℃。

43、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s4中所述与所述rnase混合的时间为10min，温度为20～25℃。

44、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s4中所述再与所述溶胶酶混合的时间为45min，温度为43℃。

45、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s4中所述第四离心的时间为1s，转速为5000rpm。

46、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s5中所述透析的时间为10～50min。

47、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s5中所述透析的时间为10min。

48、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s5中所述透析的时间为35min。

49、在本发明的一些实施方案中，上述提取方法s5中所述透析的时间为50min。

50、本发明还提供了上述核酸提取试剂或上述核酸提取试剂盒在核酸提取中的应用。

51、在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述核酸的片段长度跨度至少4个数量级。

52、在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述核酸包括长片段和短片段；所述长片段不小于1mb；所述短片段包括游离核酸。

53、本发明提供了核酸提取试剂，包括：抗凝剂、csb、lmp、红细胞裂解液、白细胞裂解液、溶菌酶、蛋白酶k、rnase、溶胶酶和透析缓冲液。

54、本发明的有益效果包括：

55、(1)本发明提供了一种针对血流感染病原菌的长短片段共提取试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒的效果可以达到：短至100bp左右的cfdna，直到长度高于2mb的病原菌gdna在同一提取管中共同提取，实现了长度跨度极大的长短片段共同提取，比现有只能分相提取的方案节省一半的时间及样本量，且因操作简便而可减少污染的可能

56、(2)本发明提供了一种提取试剂或试剂盒，可解决低至200μl全血中，各种长度的dna的提取，用菌体包埋法进行提取，同时用溶菌酶混合液浸泡法及透析法代替了了传统的机械破壁及磁珠纯化过程，最大程度可同时获得革兰氏阳性菌/阴性菌，且极大提升了提取核酸长度，并做到长(mb级别核酸)、短(游离核酸)同管共提，且获得了高纯净度核酸，以适应随后的建库测序方案，更好地服务于血流感染中的病原鉴定、耐药基因全长获得、新病原识别等功能。

57、(3)本发明提供了一种提取试剂或试剂盒，针对血流感染的血液样本，进行长度跨度4个数量级的片段，同管共提，且长片段完整度达到1m以上，覆盖菌类型齐全且纯度达标，可以满足基于上片段测序平台的血流感染的诊断需求。