食品中丙二醇的快速检测方法及其检测装置与流程

1.本发明涉及食品安全检测的技术领域，特别是涉及食品中丙二醇的快速检测方法及其检测装置，采用间接法检测食品中的丙二醇，包括丙二醇衍生物半抗原及其合成方法、丙二醇衍生物抗原、丙二醇衍生物抗体及其应用。


背景技术：

2.丙二醇，是一种粘稠的无色液体，几乎无味，有淡淡的甜味，化学式为ch3ch(oh)ch2oh，含有两个醇基，被归类为二醇。它可与多种溶剂混溶，包括水、丙酮和氯仿。一般来说，丙二醇无刺激性，且挥发性非常低。近期市场监督管理部门在抽检纯牛奶时发现含有丙二醇，根据食品安全相关法律的规定纯牛奶中是不允许添加丙二醇的。
3.目前国内外丙二醇的检测方法主要采用气相色谱（gc），高效液相色谱（hplc）等，上述方法中所用仪器设备操作复杂、成本高、对操作人员技术要求高，且不能立即显示结果，不适用于基层管理等部门对怀疑对象进行快速在线检测和监控。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。
4.建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测丙二醇，关键在于如何获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是需要合成、制备出合适的丙二醇半抗原。但是，由于丙二醇分子比较简单很难刺激机体产生抗体，因此需要对其进行衍生化，再对其衍生物进行检测，但是目前国内还没有针对丙二醇衍生化半抗原以及相关应用的免疫学快检产品的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供了食品中丙二醇的快速检测方法及其检测装置。根据本发明的一个方面，提供了丙二醇衍生物的半抗原，其结构如式（ⅰ）所示：（ⅰ），其中，n为-ch2基团的数目，n为2，3，4或5。
6.根据本发明的另一个方面，提供了制备丙二醇衍生物的半抗原的方法，包括以下步骤：s1. 将3-羟基-4硝基苯甲酸与无水甲醇在浓硫酸作用下脱水发生酯化反应得到中间体1，该步骤的反应如下式（ⅱ）所示：
式（ⅱ）；s2. 将中间体1用n,n-二甲基甲酰胺溶解后加入碱，然后加入卤代酯，60-90℃反应数小时后，经过后处理得到浅黄色黏稠油状物，即中间体2，该步骤的反应如下式（ⅲ）所示：式（ⅲ）；s3. 将中间体2与氢氧化锂发生水解反应，得到中间体3，该步骤的反应如下式（ⅳ）所示：式（ⅳ）；s4. 将中间体3与草酰氯、吡啶在0℃反应生成中间体4，反应时以n，n-二甲基甲酰胺作催化剂，将苯环上的羧酸基团转化为酰氯基团，该步骤的反应如下式（
ⅴ
）所示：式（
ⅴ
）；s5. 将中间体4与1,2-丙二醇在三乙胺条件下反应，生成中间体5，该步骤的反应如下式（ⅵ）所示：式（ⅵ）；
s6. 将中间体5溶于二氯甲烷，在三氟乙酸作用下反应，将中间体5的叔丁酯基脱除，制备得到丙二醇衍生物的半抗原，该丙二醇衍生物的半抗原的结构如式（ⅰ）所示，该步骤的反应如下式（ⅶ）所示：式（ⅶ）。
7.在一些实施方式中，步骤s2中中间体1、卤代酯与碱的摩尔比为1：（1:1.5）:（1-5），卤代酯为4-溴-丁酸叔丁酯、2-溴乙酸叔丁酯、3-溴丙酸叔丁酯、6-溴己酸叔丁酯、2-氯乙酸叔丁酯、3-氯丙酸叔丁酯或6-氯己酸叔丁酯，碱为碳酸钾或碳酸钠，步骤s3中中间体2与氢氧化锂的摩尔比为1:（1:1.5），步骤s4中中间体3、草酰氯、吡啶与n，n-二甲基甲酰胺的摩尔比为1:1:1:1，步骤s5中中间体4、三乙胺与1,2-丙二醇的摩尔比为1:（1.5-4）:（1.5-10）。
8.根据本发明的再一个方面，提供了丙二醇衍生物抗原，丙二醇衍生物抗原为丙二醇衍生物的半抗原与载体蛋白的偶联物，载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
9.根据本发明的第四个方面，提供了丙二醇衍生物抗体，是由丙二醇衍生物抗原经动物免疫制备得到，丙二醇衍生物抗体为丙二醇衍生物多克隆抗体。
10.根据本发明的第五个方面，提供了丙二醇衍生物半抗原、丙二醇衍生物抗原、丙二醇衍生物抗体在丙二醇的免疫学检测中的应用。
11.根据本发明的第六个方面，提供了一种丙二醇胶体金层析检测装置，包括试纸条和工作液，其中试纸条中的检测线包被有丙二醇衍生物抗原，工作液中包含有胶体金标记的丙二醇衍生物抗体。
12.根据本发明的第七个方面，提供了一种食品中丙二醇的快速检测方法，该方法为将食品中的丙二醇与对硝基苯甲酰氯在碱性条件下进行衍生化反应，制备得到丙二醇衍生物，然后使用一种丙二醇胶体金层析检测装置对食品中的丙二醇衍生物进行检测，本方法中制备得到的丙二醇衍生物的结构如式（
ⅷ
）所示，该衍生化反应的反应式如式（
ⅸ
）所示：式（
ⅷ
），式（
ⅸ
）。
13.本发明的有益效果：本发明提供的丙二醇衍生物的半抗原的制备方法，使用的化学试剂容易得到、操作过程简单、合成步骤简洁有效、反应产率较高、并且检测成本较低。本发明利用免疫胶体金原理，通过检测卡中检测线与质控线之间的比色来定性检测食品中是否含有丙二醇衍生物，进而确定食品中是否含有丙二醇，应用时不需要使用液相色谱或质谱等大型仪器，达到快速检测的目的。本发明应用免疫学检测方法，对食品中的丙二醇进行专属检测，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足
监管部门、检测机构现场监督执法的需要，为相关执法部门快速检测食品中是否含有丙二醇提供技术支持。
附图说明
14.图1为本发明的一种实施方案的丙二醇衍生物的质谱图。
15.图2为本发明的一种实施方案的丙二醇衍生物的核磁氢谱谱图。
16.图3为本发明的一种实施方案的丙二醇衍生物的核磁碳谱谱图。
17.图4为本发明的一种实施方案的丙二醇衍生物的半抗原的质谱图。
18.图5为本发明的一种实施方案的一种丙二醇胶体金层析检测装置的结构示意图。
具体实施方式
19.以下通过具体的实施案例对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场可购买的原料、试剂。
20.实施例1本实施例中丙二醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯1,2-丙二醇，对硝基苯甲酰氯选择国药集团化学试剂有限公司供应的98%对硝基苯甲酰氯，4-溴丁酸叔丁酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的98%4-溴丁酸叔丁酯，无水吡啶选择国药集团化学试剂有限公司供应的99.5%无水吡啶，n，n-二甲基甲酰胺选择国药集团化学试剂有限公司供应的99.8%n，n-二甲基甲酰胺，草酰氯选择国药集团化学试剂有限公司供应的98%草酰氯，三乙胺选择国药集团化学试剂有限公司供应的99.5%三乙胺，二氯甲烷选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯二氯甲烷，三氟乙酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯三氟乙酸，以下实施例2-11均采用本实施例1中的试剂。
21.实施例2丙二醇衍生物的合成与鉴定丙二醇衍生物的制备方法：称量1,2-丙二醇2g，用20ml四氢呋喃溶解后加入5ml三乙胺，室温下缓慢的分批加入对硝基苯甲酰氯3g，加完后室温下继续搅拌反应4h，反应结束后蒸干溶解，加入蒸馏水并用乙酸乙酯萃取，有机相过柱纯化，再将纯化的目标物进行重结晶，制备得到结构如式（
ⅷ
）所示的丙二醇衍生物。
22.对丙二醇衍生物进行核磁共振鉴定，得到：1h-nmr(500mhz,d
6-cdcl3,tms):δ8.29(d,2h),8.22(d,2h),4.33(m,2h),4.22(m,1h),1.98(s,1h),1.31(d,3h).
13
cnmr(500mhz,d
6-cdcl3,tms):δ164.91,150.88,135.49,130.95,123.74,70.89,68.25,19.61.其核磁氢谱、碳谱如说明书附图图2、图3所示。
23.采用质谱法鉴定丙二醇衍生物，所得到的质谱图见说明书附图图1。从质谱图可以看出，丙二醇衍生物的分子离子峰为ei-ms（positive）m/z：247.88[m+na]+且为最高峰，其与该丙二醇衍生物的分子量225.06相符，表明成功合成了式（
ⅷ
）所示的丙二醇衍生物。
[0024]
实施例3丙二醇衍生物的半抗原的合成丙二醇衍生物的半抗原的制备方法，包括以下步骤：
s1.称取3-羟基-4硝基苯甲酸2.0g，用30ml无水甲醇溶解后，缓慢加入浓硫酸2ml，回流反应5h，蒸干溶剂，加少量水有黄色固体析出，抽滤，用水洗涤黄色固体，50℃左右烘干，即得到中间体1；s2.称取3-羟基-4硝基苯甲酸甲酯1.9g，k2co32.5g，加入30mldmf溶解后80℃反应10min，加入2.5g4-溴丁酸叔丁酯（即n=3），60℃搅拌过夜，反应结束后油泵蒸干溶剂，加水溶解并用乙酸乙酯萃取2-3遍，乙酸乙酯相蒸干即得中间体2；s3.称取中间体33.5g溶于30ml无水甲醇中，将260mglioh溶于15ml蒸馏水，缓慢滴加甲醇溶液中，搅拌过夜反应，反应结束后，加1n盐酸将反应液ph值调为微酸性，旋转蒸发除去甲醇，有大量浅黄色固体析出，将固体抽滤，水洗，烘干即得中间体3；s4.在50ml单口烧瓶中，加入36ml二氯甲烷，再加入0.35gdmf，在搅拌下降温至0℃，之后加入草酰氯0.60g，体系混合均匀后加入吡啶0.38g，在吡啶加完后迅速将中间体31.5g加入体系中，保持0℃反应60min，得到中间体4；s5.称取1g1,2-丙二醇，加入到100ml单口烧瓶，加入18ml四氢呋喃搅拌均匀，然后加入三乙胺2.0g。在搅拌下降温至0℃并保持，将上步得到的中间体4用注射器抽取，滴入本反应体系，加料完成后升温至室温，室温下搅拌反应7h，反应结束后，加碳酸钠水溶液调ph至9~10，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，过柱纯化蒸干后得到中间体5；s6.将上步得到的中间体5，加入到100ml单口烧瓶，加入12ml二氯甲烷搅拌均匀，然后缓慢加入三氟乙酸6ml，室温下搅拌2h，反应完成后旋蒸去除溶剂及大量三氟乙酸，加入水及碳酸氢钠溶液，调节ph至中性，用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化得到淡黄色油状物，即制备得到丙二醇衍生物的半抗原，其结构式如式（ⅰ）所示，其中n=3。
[0025]
采用质谱法鉴定丙二醇衍生物的半抗原，所得到的质谱图见说明书附图图4。从质谱图可以看出，丙二醇衍生物的半抗原的分子离子峰为ei-ms（negative）m/z：325.92[m-h]-，且为最高峰，其与该丙二醇衍生物的半抗原的分子量327.1相符，表明成功合成了式（ⅰ）所示的丙二醇衍生物的半抗原，其中n=3。
[0026]
实施例4丙二醇衍生物免疫用抗原、丙二醇衍生物包被用抗原的合成利用实施例3制备的丙二醇衍生物的半抗原制备免疫抗原。具体地，取丙二醇衍生物的半抗原0.1mmol溶于2mldmf（n，n-二甲基甲酰胺）中，搅拌加入0.2mmoldcc（二环己基碳二亚胺）和0.15mmolnhs（n-羟基琥珀酰亚胺），于4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为a液，称取牛乳铁蛋白（lf）140mg溶于10ml浓度为0.1mol/l的pbs（ph8.0）中。加入dmf1ml，搅拌溶解制备b液，磁力搅拌下，a液逐渐滴入b液中，4℃下反应12h。离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，得到的丙二醇衍生物免疫用抗原以1mg/ml的浓度分装于0.5ml离心管中，冻存于-20℃冰箱中。
[0027]
采用与上述制备丙二醇衍生物免疫用抗原同样的制备步骤，将上述制备方法中的牛乳铁蛋白（lf）替换为牛血清白蛋白（bsa），制备得到丙二醇衍生物包被用抗原。
[0028]
实施例5丙二醇衍生物多克隆抗体的制备及纯化用丙二醇衍生物免疫用抗原与适量的immunofast快速佐剂乳化后，分别免疫3只2.5kg以上的新西兰白兔，免疫剂量为50～100μg/次，背部皮下分多点注射免疫，连续免疫2次，期间间隔2周，免疫结束后，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取igg抗体，最后再用proteina柱层析纯化，制备得到丙二醇衍生物多克隆抗体，在-20℃冻存备
用。
[0029]
实施例6丙二醇胶体金层析检测装置的制备6.1胶体金的制备取1％氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水配制成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积；6.2胶体金标记多克隆抗体的制备调节胶体金溶液ph值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入丙二醇衍生物多克隆抗体，1h后加入抗体量相当的peg，充分反应30min后加入抗体量相当的bsa，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加pnpb重悬备用；6.3胶体金检测装置的制备如图5所示，在底板上，沿同一方向依次将样品垫，喷涂有丙二醇衍生物包被用抗原（即检测线）和羊抗鼠igg（即质控线）的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连，反应杯内加入胶体金标记多克隆抗体，冻干。
[0030]
实施例7一种食品中丙二醇的快速检测方法7.1样品的预处理待测食品样品为奶粉样品，取2g奶粉，加入7ml蒸馏水完全溶解后，加入1ml15%的三氯乙酸溶液，混匀后静置5min后，取2ml上层清液（有条件的可4000r/min离心5min后取2ml上层清液）于15ml离心管中，加入0.5ml三乙胺，混匀后再加入1mol/l的对硝基苯甲酰氯溶液（对硝基苯甲酰氯溶于无水四氢呋喃中）0.5ml，60℃下衍生化反应1h，取0.5ml加入到2.5ml0.01mol/lpbs缓冲液中，制备得到待测液；7.2检测：垂直滴加9-10滴（约200μl）待测液于反应杯中，并上下抽吸10次混匀，在20-40℃条件下，开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中，在20-40℃条件下，开始第二步反应，并计时3分钟；从反应杯中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读；7.3结果判读与气相色谱的验证方法的检测结果比较：
将采用本实施例的检测方法的结果，与采用气相色谱法测定的结果进行比较，结果为：本发明的检测方法与气相色谱法的结果一致，说明本发明对奶粉样品中丙二醇的快速检测方法具有较高的准确度。
[0031]
实施例8一种食品中丙二醇的快速检测方法8.1样品的预处理待测食品样品为奶粉样品（经国标气相色谱法检测为阴性），取2g奶粉添加1，2-丙二醇（添加量为换算到待测液中1，2-丙二醇的浓度约为100μg/kg），加入7ml蒸馏水完全溶解后，加入1ml15%的三氯乙酸溶液，混匀后静置5min后，取2ml上层清液（有条件的可4000r/min离心5min后取2ml上层清液）于15ml离心管中，加入0.5ml三乙胺，混匀后再加入1mol/l的对硝基苯甲酰氯溶液（对硝基苯甲酰氯溶于无水四氢呋喃中）0.5ml，60℃下衍生化反应1h，取0.5ml加入到2.5ml0.01mol/lpbs缓冲液中，制备得到待测液；8.2检测：垂直滴加9-10滴（约200μl）待测液于反应杯中，并上下抽吸10次混匀，在20-40℃条件下，开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中，在20-40℃条件下，开始第二步反应，并计时3分钟；从反应杯中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读；8.3结果判读与气相色谱的验证方法的检测结果比较：将采用本实施例的检测方法的结果，与采用气相色谱法测定的结果进行比较，结
果为：本发明的检测方法与气相色谱法的结果一致，说明本发明对奶粉样品中丙二醇的快速检测方法具有较高的准确度。
[0032]
实施例9一种食品中丙二醇的快速检测方法9.1样品的预处理待测食品样品为牛乳样品（经国标气相色谱法检测为阴性），取9ml牛乳添加1，2-丙二醇（添加量为换算到待测液中1，2-丙二醇的浓度约为100μg/kg），加入1ml15%的三氯乙酸溶液，混匀静置5min后，取2ml上层清液（有条件的可4000r/min离心5min后取2ml上层清液）于15ml离心管中，加入0.5ml三乙胺，混匀后再加入1mol/l的对硝基苯甲酰氯溶液（对硝基苯甲酰氯溶于四氢呋喃中）0.5ml，60℃下衍生化反应1h，取0.5ml加入到2.5ml0.01mol/lpbs缓冲液中，制备得到待测液；9.2检测：垂直滴加9-10滴（约200μl）待测液于反应杯中，并上下抽吸10次混匀，在20-40℃条件下，开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中，在20-40℃条件下，开始第二步反应，并计时3分钟；从反应杯中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读；9.3结果判读与气相色谱的验证方法的检测结果比较：将采用本实施例的检测方法的结果，与采用气相色谱法测定的结果进行比较，结果为：本发明的检测方法与气相色谱法的结果一致，说明本发明对牛乳样品中丙二醇的快速检测方法具有较高的准确度。
[0033]
实施例10一种食品中丙二醇的快速检测方法10.1样品的预处理待测食品样品为米面制品（经国标气相色谱法检测为阴性），取2g米面制品添加1，2-丙二醇（添加量为换算到待测液中1，2-丙二醇的浓度约为200μg/kg），加入8ml蒸馏水混匀后，混匀静置5min后，取2ml上层清液（有条件的可4000r/min离心5min后取2ml上层清液）于15ml离心管中，加入0.5ml三乙胺，混匀后再加入1mol/l的对硝基苯甲酰氯溶液（对
硝基苯甲酰氯溶于四氢呋喃中）0.5ml，60℃下衍生化反应1h，取0.5ml加入到2.5ml0.01mol/lpbs缓冲液中，可根据检测需要适当提高稀释的倍数，制备得到待测液；10.2检测：垂直滴加9-10滴（约200μl）待测液于反应杯中，并上下抽吸10次混匀，在20-40℃条件下，开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中，在20-40℃条件下，开始第二步反应，并计时3分钟；从反应杯中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读；10.3结果判读与气相色谱的验证方法的检测结果比较：实施例11一种食品中丙二醇的快速检测方法11.1样品的预处理待测食品样品为冷冻饮品（经国标气相色谱法检测为阴性），将冷冻饮品置于干燥烧杯中解冻，待融化后用玻棒捣碎并搅拌均匀添加1，2-丙二醇（添加量为换算到待测液中1，2-丙二醇的浓度约为500μg/kg），放至室温摇匀后静置，吸取2ml上层清液（有条件的可4000r/min离心5min后取2ml上层清液）于15ml离心管中，加入0.5ml三乙胺，混匀后再1mol/l的对硝基苯甲酰氯溶液（对硝基苯甲酰氯溶于四氢呋喃中）0.5ml，60℃下衍生化反应1h，取0.5ml加入到2.5ml0.01mol/lpbs缓冲液中；11.2检测：垂直滴加9-10滴（约200μl）待测液于反应杯中，并上下抽吸10次混匀，在20-40℃条件下，开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条插入到反应杯中，在20-40℃条件下，开始第二步反应，并计时3分钟；从反应杯中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读；11.3结果判读
与气相色谱的验证方法的检测结果比较：实施例12丙二醇胶体金层析检测装置的灵敏度向阴性牛乳样品中，分别以60μg/kg、80μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg的添加量加入丙二醇，得到多个添加不同丙二醇含量的待测牛乳样品，采用实施例6制备的丙二醇胶体金层析检测装置和本实施8中的检测方法，对待测牛乳样品进行检测。
[0034]
检测结果发现，丙二醇添加量为80μg/kg、60μg/kg的待测牛乳样品检出为阴性，而添加量为100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg的待测牛乳样品检出为阳性。通过上述添加实验，本发明中丙二醇胶体金层析检测装置对丙二醇的检出限为100μg/kg，说明本发明的丙二醇胶体层析金检测装置对丙二醇的灵敏度高。
[0035]
实施例13丙二醇胶体金检测装置的特异性实验向多个阴性牛乳样品中，分别以100μg/kg的添加量加入丙二醇、以1.0g/kg的添加量加入丙三醇、以1.0g/kg的添加量加入1-氯丙二醇、以1.0g/kg的添加量加入乙二醇，得到多个含有不同添加成分的待测牛乳样品，采用实施例6制备的丙二醇胶体金层析检测装置与实施例9中的检测方法，对待测牛乳样品进行检测。
[0036]
检测结果发现，只有加入丙二醇的牛乳样品检出阳性，而加入丙三醇、1-氯丙二醇、乙二醇的牛乳样品无法检出，说明本检测装置对丙二醇的特异性较好。
[0037]
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。