一种基于CRISPR/Cas13a快速检测blaKPC基因的方法与流程

本发明属生物检测，具体涉及一种基于crispr/cas13a快速检测blakpc基因的方法。

背景技术：

1、由于近年来碳青酶烯类抗生素的大量使用和滥用，这类被誉为革兰阴性杆菌最后一道防线的药物已面临破防的风险，碳青霉烯类耐药肠杆菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae，cre)的出现和传播流行已成为全球抗感染面对的可怕对手，自2017年起cre更被wto列为21世纪最重要的耐药病原菌之一。其中，产生碳青霉烯酶是cre最重要的耐药机制，根据amber分类主要包括a、b、d三类酶，a类和d类同属丝氨酸酶，b类则是金属酶。据中国细菌耐药监测网2021年监测结果报告，我国临床分离cre中碳青霉烯酶分布特征目前仍以kpc酶为主，而kpc酶属于碳青霉烯酶中的a类水解丝氨酸酶，细菌通过产kpc酶水解碳青霉烯类抗生素使其失去活性从而产生耐药性。由于cre产生碳青霉烯酶类型不同，其对碳青霉烯类抗生素的作用方式和耐药程度也截然不同，由此临床对其治疗用药方向必须具有精确性和针对性。譬如对于产kpc水解酶和ndm金属酶这两种cre，前者酶活性可被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素、多粘菌素或头孢他啶-阿维巴坦敏感；后者酶活性不能被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素和多粘菌素敏感，少数菌株对氨曲南敏感。2020年发布的《肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识》也表明了发现cre感染时，检测并报告了碳青霉烯酶对临床尽早尽快精准抗感染治疗具有重要的指导价值。

2、目前微生物实验室多采用药敏表型检测的方法指导抗菌药物使用，该方法结果直观但需要进行细菌分离培养。对于碳青霉烯酶常见的表型检测办法有carba np试验、改良碳青霉烯灭活试验(modified carbapenem inactivation method，mcim)、edta碳青霉烯灭活试验(edta-carbapenem inactivation method，ecim)、碳青霉烯酶抑制剂增强试验，可以看到检测方法在不断进步优化虽易于检测，但只能初步鉴别碳青霉烯酶的产酶类型，无法明确耐药菌株的分子流行病学特征，更无法克服假阳性、假阴性和过夜培养耗时长的缺点。对于碳青霉烯酶常见的基因型检测方法主要包括荧光定量pcr和dna测序等分子检测技术，虽然能大大缩短检测时长并直接检测碳青霉烯酶基因型，但其通常使用的试剂仪器费用高昂，对技术环境配置和操作人员要求也较高，较难普及至基层应用。近年来，核酸等温扩增技术越来越多应用于细菌的快速检测，由于其能在某一特定温度实现核酸的快速扩增，克服了传统pcr反应条件繁琐、检测时间长的缺点，在基层检测和即时检验方面都表现出巨大的优越性和便利性。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)技术需要2对引物，反应时间需40分钟左右，但60～65℃的温度条件使反应易产生气溶胶导致结果假阳性、加阴性率高。同为核酸等温扩增技术，重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)技术只需一对特异性引物，在37～40℃反应十数分钟便可实现指数式扩增。目前rpa技术的检测方式包括琼脂糖凝胶电泳和直接荧光探针法。有大量研究包括本研究验证(图1)发现rpa产物通过琼脂糖凝胶电泳检测会出现拖带且电泳条带不清晰的现象，需经过纯化才能改善，无疑使操作更加繁琐。同时，一些低仪器配置地区实验室的病原微生物检测能力有限。多种因素迫切需要开发一种能大量投入应用于临床、操作简便、仪器试剂要求配置低、快速高效、灵敏特异的针对碳青霉烯酶类耐药基因blakpc基因新式检测技术。

3、成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/crispr associated protein 13a，crispr/cas13a)是crispr/cas蛋白家族新晋的一种核酸酶成员，近年来在扩展rna干扰、基因编辑和分子诊断多个领域应用中备受青睐。与被熟知的cas9需利用tracrrna和crrna结合切割dna不同，cas13a只需crrna就可结合并切割rna。cas13a还具有附带切割效应，其hepn结构域被crrna识别并激活后，形成cas13a-crrna-靶rna复合物，从而特异性水解靶rna及非特异性水解周围rna分子。研究可利用cas13a这一特性，识别到靶rna后对检测反应中加入的rna荧光探针携带的淬灭基团进行非特异切割，实现荧光信号检测。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种检测blakpc基因的试剂。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。

3、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒的应用。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种非疾病诊断的基于crispr/cas13a的blakpc基因的检测方法。

5、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

6、本发明的第一个方面，提供一种检测blakpc基因的试剂，所述试剂包括检测blakpc基因的crrna和/或扩增blakpc基因的引物对；所述crrna包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与cas蛋白结合，所述向导序列与所述引物对的扩增产物序列相匹配。

7、优选地，所述引物包括引物1、引物2和引物3中的至少一种；

8、kpc-f1:5’-cactgtgcagctcattcaagggctttct-3’(seq id no:1)；

9、kpc-r1:5’-aattggcggcggcgttatcactg tattg-3’(seq id no:2)；

10、所述引物2的序列为：

11、kpc-f2:5’-gttctgctgtcttgtctctcat-3’(seq id no:3)；

12、kpc-r2:5’-cggcggcgttatcactgtattg-3’(seq id no:4)；

13、所述引物3的序列为：

14、kpc-f3:5’-cttcagcaacaaattggcggcggcgttatc-3’(seq id no:5)；

15、kpc-r3:5’-ccactgtgcagctcattcaagggctttctt-3’(seq id no:6)。

16、优选地，所述kpc-r1和所述kpc-r2包含t7启动子序列，所述t7启动子序列如seqid no:8所示。

17、进一步优选地，所述t7启动子序列位于所述kpc-r1或所述kpc-r2的5’端。

18、优选地，所述kpc-f3包含t7启动子序列，所述t7启动子序列如seq id no:9所示。

19、进一步优选地，所述t7启动子序列位于所述kpc-f3的5’端。

20、优选地，所述crrna序列为

21、5’-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacucacccaucucggaaaaauaucugacaac-3’(seq id no:7)

22、优选地，所述锚定序列为

23、5’-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac-3’(seq id no:10)；

24、优选地，所述向导序列为5’-ucacccaucucggaaaaauaucugacaac-3’(seq id no:11)

25、优选地，所述cas蛋白为cas13a；进一步为lwacas13a。

26、根据cas13a蛋白的特点，在扩增的基因片段序列直接设计特异识别青霉烯酶类耐药基因blakpc基因的crrna，在ncbi中进行blast，显示是特异的青霉烯酶类耐药基因blakpc基因序列。

27、优选地，所述引物对可用于rpa技术和/或普通pcr技术。

28、本发明第二方面，提供一种包含第一方面的试剂的试剂盒。

29、优选地，所述试剂盒还包括cas蛋白。

30、优选地，所述cas蛋白选自lwacas13a、lbacas13a、camcas13a、lbucas13a、lshcas13a、rcacas13a、hhecas13a、pprcas13a、lsecas13a、lbmcas13a或lbncas13a中的至少一种；进一步为lwacas13a。

31、优选地，所述试剂盒还包括rpa缓冲液、t7 rna聚合酶、rnase抑制剂、dntps的至少一种。

32、优选地，所述试剂盒还包括信号报告探针。

33、优选地，所述信号报告探包含核酸序列，所述核酸序列的5'端修饰荧光基团，3'端修饰淬灭基团。

34、优选地，所述信号报告探的核酸序列为5’-uuuuuu-3’。

35、优选地，所述荧光基团为fam、hex、htx、vic、tamra、rox和cy5中的至少一种；进一步为fam。

36、优选地，所述淬灭基团为bhq1、bhq2和bhq3中的至少一种；进一步为bhq1。

37、通过引入信号报告探针，利用cas13a的附带切割效应，可以放大体系中的检测信号，提高检测的灵敏度。

38、本发明第三方面，提供本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒在1)～6)中任一种中的应用；

39、1)碳青霉烯酶类耐药基因blakpc基因的检测；

40、2)制备检测碳青霉烯酶类耐药基因blakpc基因的产品；

41、3)检测待测样本是否含有碳青霉烯酶类耐药基因blakpc基因；

42、4)制备检测待测样本是否含有碳青霉烯酶类耐药基因blakpc基因的产品；

43、5)筛选碳青酶烯类耐药肠杆菌的抗菌药物；

44、6)制备筛选碳青酶烯类耐药肠杆菌的抗菌药物的产品；

45、上述应用用于非疾病的诊断与治疗。

46、本发明第四方面，提供一种非疾病诊断目的的基于crispr/cas13a的blakpc基因的检测方法，包括采用本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒的步骤。

47、优选地，所述检测方法具体包括以下步骤：

48、(1)提取待测样本的核酸；

49、(2)将本发明第一方面中的引物对与步骤(1)中的核酸混合，进行rpa等温扩增，得到rpa扩增产物；

50、(3)将步骤(1)所述的rpa扩增产物与本发明第一方面中的crrna、本发明第二方面中的cas蛋白、信号报告探针、rpa缓冲液、t7 rna聚合酶、rnase抑制剂和dntps混合，进行crispr反应检测，读取检测信号；

51、(4)根据检测信号判定待测样本是否含有blakpc基因。

52、通过加入基于rpa反应的核酸扩增步骤，不仅使该检测技术的应用范围扩大到rna和dna都可以检测，同时明显提高了检测的灵敏度。

53、优选地，步骤(2)中所述rpa等温扩增的条件为37～40℃反应20～30分钟。

54、优选地，步骤(2)中所述rpa等温扩增的反应体系还包括醋酸镁和primer freerehydration buffer。

55、优选地，步骤(2)所述rpa等温扩增的反应体系每50μl包括20～25μm本发明一方面的引物、650～700mm醋酸镁和primer free rehydration buffer。

56、优选地，步骤(3)所述检测荧光强度采用荧光定量pcr仪进行。

57、优选地，步骤(3)所述反应的条件为37～40℃反应40～50分钟。

58、优选地，所述检测方法的结果判定方法为：终点相对荧光强度(final rfi)＞3600时，表示有检测信号，结果判为阳性；终点相对荧光强度(final rfi)≤3600时，表示无检测信号，结果判定为阴性。

59、本发明的有益效果是：

60、本发明提供的检测碳青霉烯酶类耐药基因blakpc基因的试剂，该试剂中的引物对可用于普通pcr技术、rpa等温扩增技术以检测快速、准确的检测碳青霉烯酶类耐药基因blakpc基因，其灵敏度高，特异性较强。针对碳青霉烯酶类耐药基因blakpc基因特异性的设计的crrna可与blakpc基因保守序列特异性形成互补双链，与其他碳青霉烯酶类耐药基因不存在交叉反应，提高了blakpc基因检测的特异性。

61、本发明所提供的一种基于crispr/cas13a的碳青霉烯酶类耐药基因blakpc基因检测的方法，不仅克服了pcr或dna测序等分子检测技术存在的操作繁琐、仪器昂贵、对实验场地和人员要求比较高、难以适用于现场大规模筛查的缺点，其两个扩增检测环节均在恒温下进行，因此整个检测过程只需一台便携恒温荧光信号检测仪即可完成，非常适用于基层单位和环境条件有限的战场使用。同时，本发明提供的检测方法的在步骤(3)crispr/cas13a检测环节仅20分钟左右即可检测到信号，即可以认为本发明提供的检测方法可在一小时左右完成检测，比传统pcr大大缩短了检测时间。最低可检测出2.5copies/μl dna，表现出优异的灵敏度。将本方法应用于检测临床菌株是否携带blakpc基因，比较crispr/cas13a检测与dna测序技术的对blakpc基因的检出率，检测结果一致性高，同时对其他耐药基因检测无交叉反应，证明其灵敏度高、特异性强。将本方法应用于直接检测痰标本中细菌是否携带blakpc基因，结果依然表现了优秀的灵敏度和准确性，检出结果与dna测序、普通pcr扩增均高度一致，同时与痰标本分离培养-药敏质谱鉴定结果也相符合。

62、进一步的，该检测方法为cre感染的早期快速筛查诊断和阐明所感染cre具体的耐药基因型提供一种新的技术手段，从而为产kpc型cre和重症感染患者的抗感染治疗提供一个准确方向，对监控院内细菌碳青酶烯酶类药物耐药性分子流行病学特征分布和传播都也具有重要意义。同时为在rpa-cas13a系统中延伸引进多个靶标通道同时检测多个耐药基因的未来研究奠定基础。