一种酚酸类化合物及其制备方法、药物组合物和应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及一种酚酸类化合物及其制备方法、药物组合物和应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种常见的慢性疾病，是世界范围内仅次于癌症和心脑血管疾病的第三大人类死亡原因，因此，糖尿病迫切的需要治疗和预防的手段。
3.α-葡萄糖苷酶是一种肠道酶，它主要催化碳水化合物消化的最后一步反应并将碳水化合物转化为单糖，因此，抑制α-葡萄糖苷酶可以延缓碳水化合物的消化吸收，最终通过控制餐后高血糖发挥降糖作用。
4.现有技术中，市面上最常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂是阿卡波糖(acarbose)，它通常被用于治疗糖尿病等糖介导的疾病，因此，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的天然产物将通过控制血糖水平有助于糖尿病及其并发症的治疗和预防。
5.山茱萸在祖国传统医学中常用于补益肝肾的方剂中，现有研究表明，该植物含有包括酚酸类化合物在内的多种化学成分。
6.迄今为止，尚未见到有关酚酸类化合物和山茱萸提取物在糖尿病防治方面的相关研究和报道。
7.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.为解决上述技术中存在的缺陷，本发明提供了一种酚酸类化合物及其制备方法、药物组合物和应用。
9.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
10.一种酚酸类化合物，具有如式(1)所示的结构：
[0011][0012]
本发明另一方面提供了上述酚酸类化合物的制备方法，具体而言，所述酚酸类化合物是从山茱萸中提取分离获得。
[0013]
进一步地，在上述技术方案中，所述酚酸类化合物的制备方法包括以下步骤：
[0014]
s1、取干燥山茱萸，加水煎煮，合并提取液后浓缩，得浸膏；
[0015]
s2、将浸膏经大孔树脂柱色谱，使用乙醇-水梯度洗脱，收集馏分后利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分a、流分b、流分c和流分d；
[0016]
将流分c经硅胶柱色谱，使用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集馏分后利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7和c8；
[0017]
将流分c4经硅胶柱色谱，使用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集馏分后利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分e1、e2、e3、e4、e5和e6；
[0018]
将流分e2、e3和e4合并后经ods柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱，收集馏分后利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分f1、f2、f3、f4、f5、f6、f7和f8；
[0019]
将流分f7经sephadex lh-20凝胶柱色谱，使用甲醇-水梯度洗脱，收集馏分后利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分g1、g2、g3、g4、g5、g6、g7、g8、g9和g10；
[0020]
s3、以乙腈-水为流动相，利用hplc法在流分g7中制备得到结构式如(1)所示的酚酸类化合物。
[0021]
再进一步地，在上述技术方案中，步骤s3中，所述流动相中乙腈-水的体积比为(17：83)-(21：79)。
[0022]
再进一步地，在上述技术方案中，步骤s1中，在所述煎煮的过程中，水的加入质量为山茱萸的5-12倍。
[0023]
再进一步地，在上述技术方案中，步骤s1中，加水煎煮的次数为2-5次，每次煎煮的时间为1-2h。
[0024]
又进一步地，在上述技术方案中，步骤s2中，将浸膏经大孔树脂柱色谱后，用体积比为(0：100)-(95：5)的乙醇-水梯度洗脱，并收集10-15个馏分。
[0025]
又进一步地，在上述技术方案中，步骤s2中，将用体积比为(50：50)-(60：40)的乙醇-水洗脱得到的流分c经硅胶柱色谱后，用体积比为(100：0)-(50：50)的三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，并收集20-30个馏分。
[0026]
又进一步地，在上述技术方案中，步骤s2中，将流分c4经硅胶柱色谱后，用体积比为(100：0)-(30：70)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，并收集20-40个馏分。
[0027]
又进一步地，在上述技术方案中，步骤s2中，将流分e2、e3和e4合并后经ods柱色谱后，用体积比为(10：90)-(100：0)的甲醇-水梯度洗脱，并收集20-40个馏分。
[0028]
又进一步地，在上述技术方案中，步骤s2中，将流分f7经sephadex lh-20凝胶柱色谱后，用体积比为(50：50)-(100：0)的甲醇-水梯度洗脱，并收集20-30个馏分。
[0029]
本发明再一方面还提供了一种含有上述酚酸类化合物的药物组合物。
[0030]
进一步地，在上述技术方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
[0031]
优选地，在上述技术方案中，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂、膏剂、冲剂、滴丸或微丸中的任一种。
[0032]
本发明又一方面还提供了上述酚酸类化合物或上述药物组合物在制备预防和治疗糖尿病及其并发症的药物中的应用。
[0033]
具体而言，本发明提供了上述酚酸类化合物或上述药物组合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药物中的应用。
[0034]
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0035]
(1)本发明提供了一种酚酸类化合物，并进一步提供了一种操作简单、重现性好、提取纯度高的从山茱萸中提取获得该酚酸类化合物的方法；
[0036]
(2)试验结果表明，本发明所提供的酚酸类化合物对α-葡萄糖苷酶具有明显的抑制作用，可以作为治疗糖尿病疾病中的药物进行应用。也可以用于制备降血糖的保健食品或功能食品方面。
附图说明
[0037]
图1为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的hr-esi-ms谱；
[0038]
图2为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的红外光谱图；
[0039]
图3为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的1h-nmr谱(400mhz，methanol-d4)；
[0040]
图4为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的
13
c-nmr谱(100mhz，methanol-d4)；
[0041]
图5为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的hmqc谱；
[0042]
图6为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的hmbc谱。
具体实施方式
[0043]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
[0044]
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0045]
实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。
[0046]
本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0047]
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0048]
在本发明的以下实施例中，所用的原料均为市售产品，未经特殊处理直接使用。
[0049]
实施例1
[0050]
一种酚酸类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0051]
s1、取干燥的山茱萸果实60kg，加水煎煮两次，在每次煎煮的过程中，均加入10倍重量的水(600kg)并煎煮2h，合并提取液后浓缩，得到浸膏；
[0052]
s2、将浸膏经大孔树脂柱色谱，使用体积比为0：100、25：75、55：45、75：25、95：5的乙醇-水梯度洗脱，共收集到12个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分a、流分b、流分c和流分d；
[0053]
将流分c(375g)经硅胶柱色谱，使用体积比为100：0、95：5、90：10、85：15、80：20、75：25、70：30、65：35、60：40、55：45、50：50的三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共收集到30个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7和c8；
[0054]
将流分c4经硅胶柱色谱，使用体积比为100：0、90：10、80：20、70：30、60：40、50：50、40：60、30：70的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共收集到20个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分e1、e2、e3、e4、e5和e6；
[0055]
将流分e2、e3和e4合并后经ods柱色谱，使用体积比为10：90、20：80、30：70、40：60、
50：50、60：40、70：30、80：20、90：10、100：0的甲醇-水梯度洗脱，共收集到30个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分f1、f2、f3、f4、f5、f6、f7和f8；
[0056]
将流分f7经sephadex lh-20凝胶柱色谱，使用体积比为50：50、60：40、70：30、80：20、90：10、100：0的甲醇-水梯度洗脱，共收集到20个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分g1、g2、g3、g4、g5、g6、g7、g8、g9和g10；
[0057]
s3、以乙腈-水(体积比为23：77)为流动相，利用hplc法在流分g7(sephadex lh-20凝胶柱色谱中用体积比为80：20的甲醇-水洗脱得到)中制备得到酚酸类化合物。
[0058]
实施例2
[0059]
一种酚酸类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0060]
s1、取干燥的山茱萸果实61kg，加水煎煮三次，在每次煎煮的过程中，均加入9倍重量的水并煎煮2h，合并提取液后浓缩，得到浸膏；
[0061]
s2、将浸膏经大孔树脂柱色谱，使用体积比为0：100、30：70、60：40、95：5的乙醇-水梯度洗脱，共收集到10个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分a、流分b、流分c和流分d；
[0062]
将流分c(350g)经硅胶柱色谱，使用体积比为100：0、90：10、80：20、70：30、60：40、50：50的三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共收集到20个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7和c8；
[0063]
将流分c4经硅胶柱色谱，使用体积比为100：0、95：5、90：10、85：15、80：20、75：25、70：30、65：35、60：40、55：45、50：50、45：55、40：60、35：65、30：70的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共收集到40个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分e1、e2、e3、e4、e5和e6；
[0064]
将流分e2、e3和e4合并后经ods柱色谱，使用体积比为10：90、15：85、20：80、25：75、30：70、35：65、40：60、45：55、50：50、55：45、60：40、65：35、70：30、75：25、80：20、85：15、90：10、95：5的甲醇-水梯度洗脱，共收集到40个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分f1、f2、f3、f4、f5、f6、f7和f8；
[0065]
将流分f7经sephadexlh-20凝胶柱色谱，使用体积比为50：50、55：45、60：40、65：35、70：30、75：25、80：20、85：15、90：10、95：5、100：0的甲醇-水梯度洗脱，共收集到30个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分g1、g2、g3、g4、g5、g6、g7、g8、g9和g10；
[0066]
s3、以乙腈-水(体积比为21：79)为流动相，利用hplc法在流分g7(sephadex lh-20凝胶柱色谱中用体积比为85：15的甲醇-水洗脱得到)中制备得到酚酸类化合物。
[0067]
实施例3
[0068]
一种酚酸类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0069]
s1、取干燥的山茱萸果实62kg，加水煎煮四次，在每次煎煮的过程中，均加入8倍重量的水并煎煮1h，合并提取液后浓缩，得到浸膏；
[0070]
s2、将浸膏经大孔树脂柱色谱，使用体积比为0：100、20：80、40：60、60：40、80：20、95：5的乙醇-水梯度洗脱，共收集到15个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分a、流分b、流分c和流分d；
[0071]
将流分c(400g)经硅胶柱色谱，使用体积比为100：0、85：15、75：25、65：35、55：45、50：50的三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共收集到20个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7和c8；
[0072]
将流分c4经硅胶柱色谱，使用体积比为95：5、85：15、75：25、65：35、55：45、45：55、35：65的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共收集到30个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分e1、e2、e3、e4、e5和e6；
[0073]
将流分e2、e3和e4合并后经ods柱色谱，使用体积比为15：85、25：75、35：65、45：55、55：45、65：35、75：25、85：15、100：0的甲醇-水梯度洗脱，共收集到30个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分f1、f2、f3、f4、f5、f6、f7和f8；
[0074]
将流分f7经sephadexlh-20凝胶柱色谱，使用体积比为55：45、65：35、75：25、85：15、95：5的甲醇-水梯度洗脱，共收集到20个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分g1、g2、g3、g4、g5、g6、g7、g8、g9和g10；
[0075]
s3、以乙腈-水(体积比为19：81)为流动相，利用hplc法在流分g7(sephadex lh-20凝胶柱色谱中用体积比为85：15的甲醇-水洗脱得到)中制备得到酚酸类化合物。
[0076]
实施例4
[0077]
一种酚酸类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0078]
s1、取干燥的山茱萸果实63kg，加水煎煮五次，在每次煎煮的过程中，均加入7倍重量的水并煎煮1h，合并提取液后浓缩，得到浸膏；
[0079]
s2、将浸膏经大孔树脂柱色谱，使用体积比为0：100、35：65、65：35、95：5的乙醇-水梯度洗脱，共收集到10个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分a、流分b、流分c和流分d；
[0080]
将流分c(325g)经硅胶柱色谱，使用体积比为95：5、90：10、85：15、80：20、75：25、70：30、65：35、60：40、55：45的三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共收集到25个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7和c8；
[0081]
将流分c4经硅胶柱色谱，使用体积比为100：0、90：10、80：20、70：30、60：40、50：50、40：60、30：70的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，共收集到30个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分e1、e2、e3、e4、e5和e6；
[0082]
将流分e2、e3和e4合并后经ods柱色谱，使用体积比为15：85、20：80、25：75、30：70、35：65、40：60、45：55、50：50、55：45、60：40、65：35、70：30、75：25、80：20、85：15、90：10、95：5的甲醇-水梯度洗脱，共收集到30个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分f1、f2、f3、f4、f5、f6、f7和f8；
[0083]
将流分f7经sephadex lh-20凝胶柱色谱，使用体积比为55：45、60：40、65：35、70：30、75：25、80：20、85：15、90：10、95：5的甲醇-水梯度洗脱，共收集到20个馏分后，利用硅胶薄层层析检识，合并依次得到流分g1、g2、g3、g4、g5、g6、g7、g8、g9和g10；
[0084]
s3、以乙腈-水(体积比为17：83)为流动相，利用hplc法在流分g7(sephadexlh-20凝胶柱色谱中用体积比为80：20的甲醇-水洗脱得到)中制备得到酚酸类化合物。
[0085]
取实施例1所制得的酚酸类化合物(褐色粉末)，对其进行分析检测。
[0086]
图1所示为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的hr-esi-ms谱；hr-esi-ms谱结果给出其准分子离子峰为331.0823[m-h]-(计算值：332.0896)，结合碳谱和氢谱确定分子式为c
17h16
o7。
[0087]
图2所示为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的红外光谱图；图2中，3427cm-1
提示该化合物的结构中含有羟基，1713cm-1
提示该化合物的结构中含有羰基。
[0088]
图3所示为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的1h-nmr谱(400mhz，methanol-d4)；分析图3可以看出：1个甲基质子信号δh 1.10(3h,t,j＝7.1hz,-ch3)，1组亚甲基质子信号δh4.00(2h,q,j＝7.1hz,-och
2-),3.49(2h,s,h-7)，3对苯环上的质子信号δh8.00(2h,d,j＝8.8hz,h-2
′
,6
′
),6.90(2h,d,j＝8.8hz,h-3
′
,5
′
),6.27(1h,d,j＝2.3hz,h-3),6.17(1h,d,j＝2.3hz,h-5)。以上信息提示其可能为连有对二取代苯环取代基的间苯三酚。
[0089]
图4所示为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的
13
c-nmr谱(100mhz，methanol-d4)；图4显示共17个碳信号，结合hsqc谱确定该化合物含有：1个甲基碳信号δc14.5(-ch3)；2个亚甲基碳信号δc61.9(-och
2-),30.3(c-7)；2组苯环上碳信号δc164.4(c-4
′
),158.7(c-4),158.5(c-6),152.5(c-2),133.6(c-2
′
,6
′
),121.5(c-1
′
),111.6(c-3
′
,5
′
),107.3(c-1),102.3(c-5),101.1(c-3)；2个羰基碳信号δc174.0(c-8),166.2(c-7
′
)。
[0090]1h-nmr信号和
13
c-nmr信号归属如下表1所示。
[0091]
表1 1
h-nmr、
13
c-nmr(400mhz，methanol-d4)信号归属表
[0092][0093][0094]
图5为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的hmqc谱；其对除季碳外的所有碳氢信号进行了直接相关确认。
[0095]
图6所示为本发明实施例1所制得的酚酸类化合物的hmbc谱；图6的hmbc谱中，h-7(δh 3.49)和-och
2-(δh 4.00)均与c-2(δc 152.5)，c6(δc 158.5)远程相关；此外，-ch3(δh 1.10)与-och
2-(δc 61.9)也具有远程相关证明苯环片段与乙酸乙酯取代基相连。
[0096]
综上所述，再结合scifinder文献数据库检索结果，最终确定了上述所提取制备的化合物的结构如式(1)所示，命名为ethyl2-o-(4-hydroxybenzoyl)-2,4,6-trihydroxyphenylacetate。
[0097]
为了更好地理解本发明的实质，下面结合活性试验及结果来说明上述酚酸类化合物在制药领域中的新应用。
[0098]
本试验例提供实施例1所制备得到的酚酸类化合物(ethyl 2-o-(4-hydroxybenzoyl)-2,4,6-trihydroxyphenylacetate)的α-葡萄糖苷酶抑制活性实验。
[0099]
实验方法
[0100]
(1)药物处理
[0101]
称取1.25mg样品至1ml ep管底部，加377μl dmso溶解，配成0.01m的溶液，储存于-20℃；用时用pbs将其稀释成40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μm用。
[0102]
选取阿卡波糖作为阳性对照药，称取6.5mg，加入1ml pbs，配成10mm的溶液。用时稀释成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mm用。
[0103]
选取α-葡萄糖苷酶作为反应酶，将冻干酶粉用pbs溶解，配制成200u/ml的的母液；储存于-20℃，用时用pbs稀释成0.125u/ml。选取pnpg作为反应底物，称取7.5mg底物置10ml ep管中，加pbs至刻度，溶解，即得2.5mm的底物溶液，4℃保存。选取碳酸钠溶液用于终止反应，称取212mg碳酸钠置10ml ep管中，加pbs至刻度，溶解，配制成0.2m的碳酸钠溶液。
[0104]
(2)mtt法的测定方法
[0105]
在96孔板中每孔依次加入pbs 100μl、α-葡萄糖苷酶(0.125u/ml)20μl、样品溶液20μl，37℃孵育15min后，加入底物pnpg(2.5mm)20μl，37℃孵育15min，加入碳酸钠溶液(0.2m)40μl终止反应，酶标仪上405nm处测定吸光度。
[0106]
抑制率(％)＝[(od
control-od
controlblank
)-(od
tes
t-od
testblank
)]/(od
control-od
controlblank
)
×
100％
[0107]
(3)统计方法
[0108]
全部资料采用graphpad prism(6.02)数据处理软件进行检验分析。各组数据用均值
±
标准误(mean
±
s.e.)表示。
[0109]
实验结果如下表3所示。
[0110]
表3对α-葡萄糖苷酶的ic
50
(mm/l)
[0111]
compoundsic
50
(μm)ethyl2-o-(4-hydroxybenzoyl)-2,4,6-trihydroxyphenylacetate7.479
±
0.18acarbose618.5
±
6.98
[0112]
表3的结果可看，所制备得到的酚酸类化合物(ethyl 2-o-(4-hydroxybenzoyl)-2,4,6-trihydroxyphenylacetate)对α-葡萄糖苷酶具有很好的抑制作用，其效果优于阿卡波糖对照药。
[0113]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。
[0114]
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。