一种猪圆环病毒2型和3型的重组基因及其应用的制作方法

1.本发明属于生物工程的技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型和3型的重组基因及其应用。


背景技术：

2.猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子直径14～17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链dna，基因组大小约为1.76kb。其血清型包括pcv1型、pcv2型、pcv3型和pcv4型。pcv1型是在1974年第一次在pk细胞培养物中发现的，但是其不会对猪致病。pcv2型于1998年被首次报导，可以分为5个基因型，分别是pcv2a、pcv2b、pcv2c、pcv2d和pcv2e。pcv3型为继pcv2型后出现的亚型，能引起猪繁殖障碍综合征、皮炎与肾病综合征(pnds)。其与已知的圆环病毒不论核酸序列还有氨基酸序列，同源性均小于50％，为一种新的猪圆环病毒。pcv3型有3个亚群，其中pcv3a，pcv3b和pcv3c。2019年4月，zhang h等在中国湖南省的几只临床疾病严重的猪身上发现了一种与其他圆环病毒有明显亲缘关系的新型圆环病毒，并命名为pcv4。pcv4与水貂圆环病毒(mink circovirus，micv)的核苷酸相似性最高(66.9％)，与其它pcv的核苷酸相似性为43.2％～51.5％。
3.分子流行病学调查表明我国黑龙江、河南、河北、新疆和湖北的养殖场中猪群pcv2和pcv3的流行情况，pcv2感染率分别为80.5％、94.6％、86.2％、30.9％和51.9％，总感染率为72.1％；pcv3感染率分别为21.4％、28.6％、37.9％、21.6％和32.7％，总感染率为26.3％；所有样本中pcv3和pcv2共感染率达18.6％。利用mega等生物信息学软件比对pcv2和pcv3的cap基因，结果表明：pcv2d基因型已经成为主要流行基因型；黑龙江和河北养殖场以pcv3a基因型为主要流行基因型；新疆养殖场以pcv3b基因型为主要流行毒株；河南，湖南和湖北养殖场以pcv3c基因型为主要流行毒株。有研究对浙江省181份猪肉及全血样品，分别用标准普通荧光pcr检测方法进行检测，结果显示，pcv2的阳性率为50.83％(92/181)，pcv3的阳性率为37.57％(68/181)，pcv2和pcv3共感染率为12.15％(22/181)。以上两份研究资料证明pcv2d为pcv2型病毒的主要流行基因型，而pcv3型的主要流行株随地域有所不同，并且pcv2型和pcv3型的共感染也有相当的比例。
4.疫苗接种是防控pcv感染的重要手段。pcv疫苗已被广泛运用，大部分养殖场都选择免疫该疫苗，但是pcv的广泛流行并没有被遏制，且进化速度依然很快。主要是因为当前的疫苗，无论是全病毒灭活疫苗还是基因工程疫苗，仅能较大程度地降低感染后的临床症状，减少感染后的排毒量和缩短排毒时间，但都不能做到阻断野毒感染。
5.根据pcv病毒株流行和进化更替趋势，目前预防的病毒亚型是pcv2d和pcv3c。由于pcv3型和pcv2型之间同源性很低，使用pcv2型疫苗不能对pcv3型病毒感染进行有效预防。为了能够向猪群提供更全面的交叉保护，pcv2型和pcv3型的二价疫苗或者同时融合有两种病毒亚型有效抗原的嵌合疫苗的研发，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型和3型的重组基因及其应用。
7.本发明的技术内容如下：
8.本发明提供了一种猪圆环病毒2型和3型的重组基因，所述重组基因为经过优化的pcv2d株orf2蛋白的编码基因与经过优化的pcv3型表位的编码基因的融合而成；
9.所述重组基因的核酸序列如序列表seq id no.1所示；
10.所述重组基因为经过优化的pcv3型表位的编码基因融合在经过优化的pcv2d株orf2蛋白的编码基因的c端得到；
11.所述经过优化的pcv2d株orf2蛋白的编码基因的核酸序列如序列表seq id no.2所示；
12.所述经过优化的pcv3型表位的编码基因的核酸序列如序列表seq id no.3所示；
13.所述经过优化的pcv3型表位的编码基因的获取：将pcv3型的orf2蛋白序列在immune epitope database(iedb)进行b细胞表位和t细胞表位的预测，选择t细胞表位和b细胞表位的重叠区域作为pcv3型的抗原表位，将其编码基因进行优化，得到的核酸序列如序列表seq id no.3所示；
14.所述优化前的pcv2d株orf2蛋白的编码基因的核酸序列如序列表seq id no.4所示；
15.所述优化前的pcv3型表位的编码基因的核酸序列如序列表seq id no.5所示。
16.本发明还提供了一种猪圆环病毒2型和3型的重组基因用于制备成猪圆环病毒2型和3型的融合蛋白，其氨基酸序列如序列表seq id no.6所示。
17.本发明还提供了一种猪圆环病毒2型和3型的重组基因用于制备成猪圆环病毒2型和3型的病毒样颗粒。
18.本发明还提供了一种猪圆环病毒2型和3型的重组基因用于制备成猪圆环病毒2型和3型的疫苗。
19.本发明的有益效果如下：
20.本发明的猪圆环病毒2型和3型的重组基因，通过获得有效的pcv3c病毒抗原表位的编码基因，根据pcv2d orf2蛋白的结构特点，在其基因c端融合pcv3c抗原表位基因，得到该重组基因，对应的融合蛋白能在大肠杆菌实现高水平的可溶表达，生产成本、工艺上经济实用；纯化阶段，用有利于目的蛋白溶出的裂解液重悬菌体，高压破碎，再经过硫酸铵沉淀和大孔径阴离子柱纯化两步工艺，得到大量正确组装的pcv-2-3vlps，纯化工艺简单；得到的嵌合vlps在小鼠中能同时诱导出高水平的pcv2d病毒和pcv3c病毒中和抗体，表明了
①
该重组基因的设计在蛋白表达层面比较合理，即能够在大肠杆菌中表达出大量的可溶蛋白；
②
该重组基因翻译出的蛋白，在小鼠的免疫评价中，与灭活疫苗比较，表现出较好好的诱导中和抗体的能力；
③
该重组基因的设计具有良好的应用前景。
附图说明
21.图1为pcv-2-3蛋白表达和纯化检测结果；
22.图2为pcv-2-3嵌合病毒样颗粒的电镜观察结果图；
23.图3为pcv-2-3疫苗的抗体检测结果；
24.图4为pcv2d病毒的中和抗体结果；
25.图5为pcv3c病毒的中和抗体结果。
具体实施方式
26.以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定。
27.若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
28.实施例1
29.一种猪圆环病毒2型和3型的重组基因的创建
30.1.选取pcv2d(porcine circovirus 2strain d3276/5/16/hu)株orf2蛋白的编码基因(其核酸序列如序列表seq id no.4所示)进行突变、序列优化，得到的核酸序列如序列表seq id no.2所示；
31.2.选取pcv3型(porcine circovirus 3strain pcv3/cn/jiangxi-b1/2017)的orf2蛋白序列(其核酸序列如序列表seq id no.5所示)在immune epitope database(iedb)进行b细胞表位和t细胞表位的预测，选择t细胞表位和b细胞表位的重叠区域作为pcv3型的抗原表位的编码基因进行序列优化，得到的核酸序列如序列表seq id no.3所示；
32.3.将pcv3型抗原表位的编码基因融合在pcv2d sh株orf2蛋白的编码基因的c端，得到猪圆环病毒2型和3型的重组基因，其核酸序列如序列表seq id no.1所示。
33.实施例2
34.一种猪圆环病毒2型和3型的重组质粒的构建
35.1.重组菌的构建和重组蛋白的制备
36.1.1将实施例1所得的猪圆环病毒2型和3型的重组基因，提交给南京金斯瑞生物技术有限公司进行全基因合成，目的基因5’端和3’端加bamhi和hindiii酶切位点，构建于骨架载体pet-30a(+)，获得表达质粒pet-30a-pcv-2-3，转化大肠杆菌bl21(de3)表达菌株；
37.1.2所述表达菌株还包括overexpress c43(de3)、shuffle t7等常用表达菌株中的一种；
38.1.3挑选转化正确的菌落接种到含有50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养基中，37℃震荡培养至od
600
为0.8左右时，于25℃培养30分钟，加入终浓度为0.3mm的iptg，25℃震荡培养24小时；
39.1.4 4000g离心10分钟收集诱导的菌体，菌体加入10倍菌体质量的裂解液，1200bar高压破碎2次，破碎后离心(4℃，15000g，15min)，所得上清液即包含pcv-2-3vlps病毒样颗粒；
40.1.5用30％硫酸铵沉淀目的蛋白，4℃，10000g，10分钟离心收集沉淀，沉淀用40mm tris，0.1m nacl，ph 8.0溶液复溶。复溶的溶液离心澄清，再用加莱克系列离子交换色填料glksupermax d70纯化。所用平衡液：40mm tirs，0.1m nacl，ph 8.0；洗脱液：40mm tirs，0.5m nacl，ph 8.0。
41.2.病毒样颗粒的检测
42.经硫酸铵沉淀和阴离子柱纯化得到pcv-2-3嵌合病毒样颗粒样品；
43.将纯化产品滴于铜网上，染色、干燥后在透射电镜下观察病毒样颗粒的形成情况，其电镜观察结果如图2所示：
44.3.疫苗配制
45.纯化后的蛋白原液调整浓度，使其终浓度为1mg/ml，免疫佐剂使用gel佐剂，佐剂与蛋白原液按照1:10的比例充分乳化，制成疫苗，每份疫苗的剂量为0.1ml。
46.试验例
47.小鼠免疫实验
48.将实验用的6周龄的雌性小白鼠(45只)随机分为3组，每组15只，分别标记为a组、b组、c组。a组皮下注射0.1ml上述疫苗，b组皮下注射灭活疫苗，c组皮下注射100μl的pbs作为阴性对照。2周以后，对小鼠进行第二次免疫，免疫的方法、途径、剂量都与首次免疫时完全相同。在首次免疫后的第28天采血，分离血清，56度水浴处理30min，并1:500稀释，用来检测总抗体水平以及pcv2d和pcv3c的中和抗体水平。
49.总抗体水平测定：蛋白按100ng/孔的用量包被于96孔酶标板，4℃过夜包被；第二天弃去包被液，pbst洗涤3次，每次3min；加入200μl封闭液，37℃封闭2h；倒掉封闭液加入第28天采血的血清100μl，37℃作用2h；洗涤5次，加入hrp标记的羊抗鼠igg二抗，37℃孵育1h；洗涤5次，加入新配置的dab底物缓冲液100μl，室温作用3min；加入50μl 2m硫酸，终止显色反应，酶标仪读取od
450
值，抗体检测结果如图3所示。
50.pcv2d和pcv3c的中和抗体检测：提前将pk15细胞接种于96孔培养板中，随即稀释pcv2d hh3株(porcine circovirus type 2，strain hh3)和pcv3c sg株(porcine circovirus type 3，strain sg)病毒液至200tcid 50
/ml；将待检血清按照每孔50μl在新的96孔板上做2倍连续倍比稀释，随后与稀释好的病毒悬液1:1混合，放置1h；
51.将两种病毒与血清的混合液感染pk15细胞，二氧化碳培养箱中，37℃，5％co2培养，观察细胞病变情况，计算免疫血清的中和抗体效价，pcv2d和pcv3c病毒的中和抗体结果分别如图4和图5所示。