用于抗斑萎病烟草13号染色体背景筛选的引物组及其应用的制作方法

本发明属于烟草育种领域，涉及用于鉴别抗斑萎病烟草回交育种过程中供体亲本polalta和回交亲本k326基因型的引物组，特别是用于抗斑萎病烟草13号染色体背景筛选的引物组及其在k326烟草抗斑萎病定向改良或抗斑萎病烟草品种选育中的应用。

背景技术：

1、在作物生产中，一些优良品种在产量、农艺等诸多重要性状方面表现突出，然而由于个别性状(如抗病性、抗虫性等)表现不好，常导致产量、品质潜力难以充分发挥，制约了大面积种植。品种定向改良，就是针对已有主栽品种或特色品种的个别缺陷性状，通过回交育种把优良的目标性状从供体导入到轮回亲本，并保持轮回亲本所具有的其他优良性状，是育种家改良品种单个或少数不良性状的一项有效、重要的育种方法。定向改良后的品种，其遗传背景、其他性状与原优良品种一致，是原优良品种的升级版。

2、在现代育种中，通过分子标记辅助选择极大地加速了定向改良育种的进程。特别是分子标记辅助的回交背景选择，能利用分子标记在回交后代中选择与轮回亲本基因组一致的单株，能减少回交世代，在短世代内达到定向改良的目的。理论上说，分子标记辅助的回交育种是单个或多个由主效基因控制的性状定向改良的最快、最优育种方案。对比常规回交育种定向改良，分子标记辅助回交背景选择使得改良的品种提前进入市场。

3、烟草斑萎病(tobacco spotted wilt disease,tswd)是由正番茄斑萎病毒属病毒(orthotospoviruses)侵染所造成的严重病害。番茄斑萎病毒(tomato spotted wiltvirus，tswv)是正番茄斑萎病毒属病毒的代表种。具翼烟草(n.alata)是烟草属中的一种野生烟草，对tswv具有很好的抗性，也是迄今为止唯一的可利用的烟草斑萎病抗源。gajos等人利用耳状烟草(n.otophora)作为桥梁亲本，成功地将抗斑萎病基因位点(rtsw位点，其中rtsw是resistance to tswv的简称)从野生烟草(n.alata)转育至栽培烟草(n.tabacuml.)中，获得了抗斑萎病烟草的育种材料‘polalta’。‘polalta’为一个含有深色晾烟血统的欧洲品系，与中国和国际市场上占主导地位的烤烟品系有较大的的背景差异。以polalta为父本、烤烟主栽品种k326为母本进行杂交，虽然可以获得农艺性状和主栽品种无显著差异的抗斑萎病烟草，但获得的抗斑萎病烟草与主栽品种之间仍然存在体内代谢产物和化学成分的差异，造成风格特征不能完全满足烤烟工业生产需求的风险。为了在烟草斑萎病改良的烤烟主栽品种中规避这一风险，需要利用抗斑萎病烟草进行回交育种，定向改良主栽烤烟品种的斑萎病抗性。利用分子标记进行回交辅助背景选择可以加速烤烟抗斑萎病定向改良的进程。

4、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)在基因组中分布相当广泛，是植物个体间最常见的遗传变异形式，常出现的单核苷酸多态性包括碱基的替换、颠换、插入和缺失。在基因组广泛分布的snp大部分并不直接决定表型，但因其与决定表型的位点紧密连锁，可以开发成为重要的分子标记。snp已经成为植物复杂性状遗传研究的最理想的分子标记之一。

5、竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)是通过引物末端碱基的特异匹配来对snp分型。基本原理为末端碱基不同的两条引物分别携带荧光接头序列，根据扩增产物所携带的不同的荧光信号，可以快速对大量样本进行检测，准确判断其基因型。kasp技术自面世以来，以其超高的灵活性、准确度和性价比迅速抢占市场，在作物辅助育种中具有重要作用。

6、目前，在烟草的抗斑萎病回交转育中，还未见利用共显性kasp标记进行背景选择的报道。开发基于前景供体亲本和背景回交亲本的共显性特异kasp分子标记，能够快速准确、低成本、高通量、自动化地实现回交单株背景回复率的检测，加速烤烟主栽品种抗斑萎病的定向改良。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供用于抗斑萎病烟草13号染色体背景筛选的snp标记、引物组合及方法，以促进k326烟草抗斑萎病的定向改良。

2、为解决上述技术问题，本发明提供用于抗斑萎病烟草育种背景筛选的pcr引物组合，其包括第一pcr引物组和/或第二pcr引物组；

3、所述第一pcr引物组由核苷酸序列如seq id no:1-3所示的三条引物组成；所述第二pcr引物组由核苷酸序列如seq id no:4-6所示的三条引物组成；

4、所述抗斑萎病烟草为供体亲本polalta烟草和受体亲本k326烟草的杂交及回交后代；

5、所述第一pcr引物组用于扩增烟草13号染色体上1553823bp处的snp位点，在此位点k326烟草的基因型为c，polalta烟草的基因型为a；

6、所述第二pcr引物组用于扩增烟草13号染色体上3327176bp处的snp位点，在此位点k326烟草的基因型为g，polalta烟草的基因型为a；

7、其中snp位点在染色体上的位置是基于k326烟草的全基因组序列而确定的。

8、本发明还提供用于抗斑萎病烟草育种背景筛选的kasp引物组合，其包括第一kasp引物组和/或第二kasp引物组；

9、所述第一kasp引物组由f1-1，f1-2和r1三条引物组成，其中f1-1从5’端至3’端由第一标签序列与seq id no:1所示的核苷酸序列串联而成；f1-2从5’端至3’端由第二标签序列与seq id no:2所示的核苷酸序列串联而成；r1的核苷酸序列如seq id no:3所示；

10、所述第二kasp引物组由f2-1，f2-2和r2三条引物组成，其中f2-1从5’端至3’端由第一标签序列与seq id no:4所示的核苷酸序列串联而成；f2-2从5’端至3’端由第二标签序列与seq id no:5所示的核苷酸序列串联而成；r2的核苷酸序列如seq id no:6所示；

11、所述第一标签序列和所述第二标签序列的核苷酸序列不同并且与烟草基因组序列不同源；

12、所述抗斑萎病烟草为供体亲本polalta烟草和受体亲本k326烟草的杂交及回交后代；

13、所述第一kasp引物组用于扩增烟草13号染色体上1553823bp处的snp位点，在此位点k326烟草的基因型为c，polalta烟草的基因型为a；

14、所述第二kasp引物组用于扩增烟草13号染色体上3327176bp处的snp位点，在此位点k326烟草的基因型为g，polalta烟草的基因型为a；

15、其中snp位点在染色体上的位置是基于k326烟草的全基因组序列而确定的。

16、本发明提供一种试剂盒，其包含上述pcr引物组合或上述kasp引物组合。

17、在本发明的一些实施例中，所述试剂盒包含上述kasp引物组合和pcr预混液；所述pcr预混液包含第一荧光探针、第一淬灭探针、第二荧光探针和第二淬灭探针；

18、所述第一荧光探针的核苷酸序列与kasp引物组中的第一标签序列的核苷酸序列一致，其5’端连接第一荧光基团；所述第一淬灭探针的核苷酸序列与所述第一标签序列的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；

19、所述第二荧光探针的核苷酸序列与kasp引物组中的第二标签序列的核苷酸序列一致，其5’端连接第二荧光基团；所述第二淬灭探针的核苷酸序列与所述第二标签序列的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团。

20、在本发明的一些实施例中，所述第一标签序列为gaaggtgaccaagttcatgct；所述第二标签序列为gaaggtcggagtcaacggatt；所述第一荧光基团为fam，所述第二荧光基团为hex。

21、上述pcr引物组合或上述kasp引物组合或上述试剂盒在抗斑萎病烟草育种中的应用也属于本发明的保护范围。

22、本发明提供一种抗斑萎病烟草育种背景的筛选方法，其包括以下步骤：

23、a)提取抗斑萎病烟草的dna；

24、b)使用上述pcr引物组对所述抗斑萎病烟草的dna进行pcr扩增；

25、c)检测扩增结果，确定所述抗斑萎病烟草在每个pcr引物组扩增的snp位点的基因型，筛选snp位点为k326烟草基因型的抗斑萎病烟草；

26、所述抗斑萎病烟草为供体亲本polalta烟草和受体亲本k326烟草的杂交及回交后代。

27、本发明还提供一种抗斑萎病烟草育种背景的筛选方法，其包括以下步骤：

28、a)提取抗斑萎病烟草的dna；

29、b)向所述抗斑萎病烟草的dna中加入上述kasp引物组和pcr预混液，进行kasp扩增；

30、所述pcr预混液含有第一荧光探针、第一淬灭探针、第二荧光探针和第二淬灭探针；

31、所述第一荧光探针的核苷酸序列与kasp引物组中的第一标签序列的核苷酸序列一致，其5’端连接第一荧光基团；所述第一淬灭探针的核苷酸序列与所述第一标签序列的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；

32、所述第二荧光探针的核苷酸序列与kasp引物组中的第二标签序列的核苷酸序列一致，其5’端连接第二荧光基团；所述第二淬灭探针的核苷酸序列与所述第二标签序列的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；

33、c)检测荧光信号，确定所述抗斑萎病烟草在每个kasp引物组扩增的snp位点的基因型，筛选snp位点为k326烟草基因型的抗斑萎病烟草；

34、所述抗斑萎病烟草为供体亲本polalta烟草和受体亲本k326烟草的杂交及回交后代。

35、在本发明的一些实施例中，所述第一标签序列为gaaggtgaccaagttcatgct；所述第二标签序列为gaaggtcggagtcaacggatt；所述第一荧光基团为fam，所述第二荧光基团为hex。

36、在本发明的一些实施例中，所述kasp扩增中，

37、pcr体系包含：dna模板、kasp引物工作液和kasp-tf v4.0 2x master mix；

38、pcr程序如下：第一步，95℃预变性15min；第二步，95℃变性20s、65-57℃(每个循环下降1℃)60s，共9个循环；第三步，95℃变性20s、57℃复性1min，32个循环。

39、经实验证明，利用本发明开发的kasp引物组，以待测烟草基因组dna为模板进行pcr扩增，然后通过荧光信号检测对pcr扩增产物进行基因分型，通过分型结果即可快速、准确筛选具有回交亲本k326烟草13号染色体背景的抗斑萎病烟草。通过一条染色体上连续分布的snp标记筛选，可以保证整条染色体仅含有回交亲本基因型。与以往的传统标记筛选相比，本发明开发的snp-kasp引物组具有准确性高、成本低廉、检测效率高等优点，适用于大规模抗斑萎病烟草育种筛查。采用本发明的snp-kasp引物组的鉴定方法可以对抗斑萎病烟草育种背景进行早世代筛选，极大地缩短k326烟草抗斑萎病定向改良的育种周期，提高育种效率。

40、本发明使用的术语“rtsw位点”或“抗斑萎病基因位点”是指包含rtsw基因的dna片段，该位点在杂合或者纯合状态都赋予烟草植株抗烟草斑萎病性状。“rtsw基因”是指来源于具翼烟草(n.alata)基因组并赋予植物具有抗斑萎病性状的基因。