HBA1/2单基因缺陷检测的引物组合物、方法和试剂盒与流程

本发明涉及基因检测，具体为一种hba1/2单基因缺陷检测的引物组合物、方法和试剂盒。

背景技术：

1、α-地中海贫血是世界范围内的高发的单基因遗传病，其是由于α珠蛋白肽链的合成受到部分或完全的抑制，而导致血红蛋白（hb）合成不足而引发的遗传性溶血性贫血，呈常染色体隐性遗传，致病基因为hba1（omim141800）和hba2（omim141850）,男女患病几率相等。目前对于携带某些已知遗传异常的夫妇，大多采用生殖医学中胚胎植入前单基因病遗传学检测(pgt-m)，通过在胚胎植入前进行单基因病检测，以排除“患病”胚胎，挑选出未携带致病突变的胚胎进行移植，以避免后代承受遗传病带来的痛苦。

2、用于pgt-m检测的细胞通常数量较少（3-10个细胞），为了保证获得足够的dna用本用于后续检测，通常需要对细胞样本进行全基因组扩增，随之会引入脱扣现象，即等位基因中有一个被优势扩增，而另一个则被抑制的情况。因此，在进行pgt-m检测时，还需要检测致病基因上下游连锁标记位点，通过连锁分析判定后代胚胎是否携带来自父母的风险染色体。例如，对于α-地中海贫血的pgt-m，采用多重pcr对hba1/2单基因及其上下游临近范围的snp位点进行靶向捕获，经二代测序分析后，对每个snp位点进行判读，实现对hba1/2单基因的单体型构建，最终评估子代胚胎是否遗传了来自父亲和（或）母亲携带含有致病突变的地贫基因的风险染色体。靶基因中snp位点的选择应避免同源性高、gc含量高或有多聚核苷酸的序列。但是由于hba1/2单基因位于染色体末端，而部分家庭在hba1/2基因端粒侧存在无法找到足够有效位点的情况，出现了不能排除胚胎重组的可能，进而导致构建单体型失败，无法判断该胚胎是否为合格胚胎的问题。

3、短串联重复序列(str)是一种遍布于人类染色体上的2~6bp的多态性重复dna序列，由于str具有高度的多态性，且其重复序列较短、容易通过pcr扩增、检测方便，因此在遗传图谱绘制、致病基因定位、群体遗传学以及生殖医学等领域有极为重要的应用价值。目前也有采用str构建单体型的方法，对胚胎是否携带致病突变进行分析，从而判断该胚胎是否为合格胚胎。但是使用str构建单体型时通常会遇到：滑脱现象严重影响str检测分析的准确性；str构建单体型以毛细管电泳为主，检测方案通量低，且不同str位点之间可能存在信号干扰的问题；hba1/2单基因已公开的str位点较少，难以满足不同临床应用的需求等问题。

4、因此，需要对上述hba1/2单基因检测的方法进行改进，以提高hba1/2单基因病检测的准确率，确保植入前胚胎筛选的准确度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于设计一种hba1/2单基因缺陷检测的引物组合物、方法和试剂盒， 通过对hba1/2单基因中snp位点及str位点进行筛选，并根据筛选的snp位点和str位点制备引物组合物，对植入前胚胎是否有存在变异/突变情况进行鉴定，以更高效、更准确的筛选出合格的胚胎进行植入，达到以降低患病风险的目的。

2、实现发明目的的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种hba1/2单基因缺陷检测的引物组合物，包括：

4、依据hba1/2单基因区域中筛选的snp位点设计的第一组引物组合物，所述第一组引物组合物为seq id no：（2n-1）和 seq id no：（2n）中对应的正向引物和反向引物，n为 1~467的正整数；

5、依据hba1/2单基因区域中筛选的str位点设计的第二组引物组合物，所述第二组引物组合物为seq id no：（2n-1）和 seq id no：（2n）中对应的正向引物和反向引物，n为468~496的正整数。

6、进一步的，hba1/2单基因区域中筛选snp位点的范围为hba1/2单基因及其上下游3mb范围内的dna片段，且所述第一组引物组合物包括：

7、依据hba1/2单基因上游筛选的snp位点设计的引物组合物一，所述引物组合物一为seq id no：（2n-1）和 seq id no：（2n）中对应的正向引物和反向引物，n为 1~164的正整数；

8、依据hba1/2单基因筛选的snp位点设计的引物组合物二，所述引物组合物二为seqid no：（2n-1）和 seq id no：（2n）中对应的正向引物和反向引物，n为 165~184的正整数；

9、依据hba1/2单基因下游筛选的snp位点设计的引物组合物三，所述引物组合物三为seq id no：（2n-1）和 seq id no：（2n）中对应的正向引物和反向引物，n为 185~467的正整数。

10、更进一步的，snp位点的筛选原则包括：

11、（1）snp位点的最小等位基因频率大于等于0.2；

12、（2）去除含有多聚核苷酸的snp位点；

13、（3）去除上下游200 bp范围内gc含量大于60%的snp位点；

14、（4）去除上下游200 bp序列在人类基因组中具有同源性的snp位点。

15、进一步的，hba1/2单基因区域中筛选str位点的范围为hba1/2单基因及其上游200kb范围内的dna片段，且所述第二组引物组合物包括：

16、依据hba1/2单基因上游筛选的str位点设计的引物组合物四，所述引物组合物四为seq id no：（2n-1）和 seq id no：（2n）中对应的正向引物和反向引物，n为 468~494的正整数；

17、依据hba1/2单基因筛选的str位点设计的引物组合物五，所述引物组合物五为seqid no：（2n-1）和 seq id no：（2n）中对应的正向引物和反向引物，n为 495~496的正整数。

18、更进一步的，str位点的筛选原则包括：

19、（1）、去除含有多聚核苷酸的str位点；

20、（2）、保留多态信息量pic＞0.2的str位点；

21、（3）、保留重复单元碱基数为3，4，5，6的str位点；

22、（4）、去除总长大于150bp的str位点；

23、（5）、去除上下游200 bp范围内gc含量大于60%的str位点；

24、（6）、去除上下游200 bp序列在人类基因组中具有同源性的str位点。

25、第二方面，本发明提供了一种hba1/2单基因缺陷检测的试剂盒，包括第一方面中所述的引物组合物，以及超级反应液、末端修复试剂、接头连接试剂、扩增反应试剂。

26、进一步的，所述超级反应液包括1.5×～2.5×pcr缓冲液、150～250 u/ml热启动taq酶、5～15 u/ml udg酶、0.2～0.6 mm dntp、0.2～0.4 mm dutp、2～8 mm mgcl2、0.5％～2.5％ bsa、0.5％～2.5％甘露醇。

27、进一步的，所述末端修复试剂包含dna片段末端修复及加a缓冲液end-repair&adenytion buffer mix、dna片段末端修复及加a酶混合物end-repair&adenytion enzymemix、无核酸酶水nuclease-free water。

28、进一步的，所述接头连接试剂包含连接酶混合物ligase enzyme mix、接头序列barcode adapter。

29、进一步的，所述扩增反应试剂包含文库扩增酶混合物pcr enzyme mix、文库扩增引物混合物pcr primer mix、无核酸酶水nuclease-free water。

30、第三方面，本发明提供了一种hba1/2单基因缺陷检测方法，包括以下步骤：

31、步骤一、获取先证者dna样本、亲代双方dna样本、子代胚胎dna样本；

32、步骤二、采用第一方面中所述的引物组合物或第二方面中所述的试剂盒对先证者dna样本、亲代双方dna样本进行多重pcr扩增，构建dna文库并进行测序分析；

33、步骤三、基于测序分析结果，获得先证者、亲代双方的单体型；

34、步骤四、根据得先证者、亲代双方的单体型，对子代胚胎hba1/2单基因缺陷进行判断。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

36、1.本发明采用对hba1/2单基因区域的dna片段中按照规则筛选snp位点和str位点并设计引物组合物，采用引物组合物对样本进行多重pcr并建库，最后进行高通量测序分析。通过结合家系信息构建突变等位基因的单体型，从而判断子代胚胎基因型，以确定子代胚胎的hba1/2基因缺陷检测结果，本发明设计的方案基于高通量测序技术，省去了细胞水平预实验，可以一次性对大量样品进行分析，且平均测序深度可达100x以上，大大提高了检测的效率及检测结果的准确度。

37、2.常用的连锁位点包括snp位点与str位点。snp位点常见于连锁分析，但str位点由于具有一定长度，并且易发生滑脱等现象，导致str位点很少用于连锁分析中。而由于单基因hba1/2距16号染色体端粒侧仅约200 kb，按照常规方案仅检测snp位点会有部分家系不能检测到足够的有效snp位点，因此本技术将snp位点和str位点组合形成连锁位点进行分析，其可以最大程度的降低ado造成的误诊。