一种利用酵母细胞表面展示技术开发膀胱肿瘤抗原单克隆抗体的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种利用酵母细胞表面展示技术开发膀胱肿瘤抗原单克隆抗体的方法。


背景技术：

2.膀胱肿瘤是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，根据2019年发布的数据显示，2015年我国膀胱癌发病率为5.80/10万，位居全身恶性肿瘤的第13位，其中膀胱癌男性发病率8.83/10万，位居第7位，女性发病率2.61/10万，位居第17位；2015年我国膀胱癌死亡率为2.37/10万，位居全身恶性肿瘤的第13位，其中膀胱癌男性死亡率3.56/10万，位居第11位，女性死亡率1.11/10万，位居第16位。约70％膀胱肿瘤最初表现为浅表性病变，复发率高达65％～85％。近些年，虽然取得了一定的临床疗效，但由于膀胱肿瘤高复发率、高转移率和预后差等特点，其病死率一直居高不下，因此需要早期诊断和长期随访。
3.胶体金免疫层析法是在elisa基础上发展起来的一种检测技术，该法所用试剂全部为干试剂，多个试剂被结合在一个约6mm
×
70mm的塑料板条上，试纸条两端附有吸水材料，成为单一试剂条，实验过程短，是“床边检验”的主要方法之一。它用胶体金标记抗原和抗体后以层析方法进行检测，突出优点为快速、试剂便于保存和检测不需要特殊设备，并可以单份检测，适合急诊检测；但灵敏度和特异性稍差，比较适合用于基层医疗单位和标本初筛。目前已有成熟的胶体金试纸条，如hcg金标纸条，广泛应用于临床检测。
4.膀胱肿瘤抗原(bladder tumour antigen，bta)(bladder tumour antigen，bta)，是由膀胱肿瘤细胞分泌的人补体因子h相关蛋白，可与基底膜表面相关受体结合，释放蛋白水解酶水解基底膜，从而使基底膜水解碎片成分释放至膀胱尿液中形成高分子复合物，直接参与肿瘤细胞的发生、发展、侵袭和转移过程，可作为膀胱肿瘤早期发生和复发的特异性诊断标志物之一。
5.目前，腹部膀胱彩超、静脉尿路造影、尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查等是膀胱癌诊断的主要方法，但这些诊断方法均存在一定的弊端，腹部膀胱彩超虽然简便易行、灵敏度高，但不适用于早期膀胱癌或微小病灶的诊断；静脉尿路造影使用并不普遍，主要与造影剂易引起不良反应有关；尿脱落细胞学检查灵敏度较低；膀胱镜检查和病理活检虽是膀胱癌诊断的“金标准”，但属于有创操作，可能导致二次感染，耐受性较差。


技术实现要素：

6.基于此，本发明的目的是提供一种利用酵母细胞表面展示技术开发膀胱肿瘤抗原单克隆抗体的方法得到理想的膀胱肿瘤抗原单克隆抗体。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用酵母细胞表面展示技术开发膀胱肿瘤抗原单克隆抗体的方法，其具体步骤如下：
8.步骤a：获取人补体因子h相关蛋白序列，设计bta抗原序列；
9.步骤b：bta抗原表达及纯化；
10.步骤c：抗原免疫兔子；
11.步骤d：提取脾脏组织rna；
12.步骤e：获取抗体fab基因；
13.步骤f：建立fab抗体酵母文库；
14.步骤g：检测酵母的细胞阳性率；
15.步骤h：抗体性能测试。
16.优选地，所述步骤e中获取抗体fab基因包括以下步骤：
17.e1：设计并合成fab基因引物；
18.e2：反转录提取的脾脏组织rna，获得cdna；
19.e3：pcr获得fab基因。
20.优选地，所述步骤f中建立fab抗体酵母文库包括以下步骤：
21.f1：载体线性化；
22.f2：制备酵母感受态；
23.f3：将步骤e的fab片段和f2的线性化载体电转入酵母细胞。
24.优选地，所述步骤g中流式细胞仪检测酵母的细胞阳性率包括以下步骤：
25.g1：培养酵母；
26.g2：用磁珠、bta抗原孵化酵母；
27.g3：分别用ha tag antibody ifluor 488、his tag antibody ifluor 647孵化酵母；
28.g4：流式细胞仪检测酵母的细胞阳性率。
29.优选地，所述步骤n中的抗体性能测试包括以下步骤：
30.n1：亲和力检测；
31.n2：效价检测。
32.综上所述，本发明主要具有以下有益效果：本发明应用酵母细胞表面展示技术，实现了膀胱肿瘤抗原单克隆抗体开发，开发的抗体后续可作为关键原料应用于胶体金免疫层析技术中检测尿膀胱肿瘤抗原，联合腹部膀胱彩超、静脉尿路造影、尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查等手段，确诊是否有膀胱肿瘤以及膀胱肿瘤术后的随访和复查。
附图说明
33.图1为本发明的流程结构示意图。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
35.下面根据本发明的整体结构，对其实施例进行说明。
36.实施例：
37.一种利用酵母细胞表面展示技术开发膀胱肿瘤抗原单克隆抗体的方法，其具体步
骤如下：
38.步骤a：获取人补体因子h相关蛋白序列，设计bta抗原序列；
39.步骤b：bta抗原表达及纯化；
40.步骤c：抗原免疫兔子；
41.步骤d：提取脾脏组织rna；
42.步骤e：获取抗体fab基因；
43.步骤f：建立fab抗体酵母文库；
44.步骤g：检测酵母的细胞阳性率；
45.步骤h：抗体性能测试。
46.在本发明中，所述步骤e中获取抗体fab基因包括以下步骤：
47.e1：设计并合成fab基因引物；
48.e2：反转录提取的脾脏组织rna，获得cdna；
49.e3：pcr获得fab基因。
50.在本发明中，所述步骤f中建立fab抗体酵母文库包括以下步骤：
51.f1：载体线性化；
52.f2：制备酵母感受态；
53.f3：将步骤e的fab片段和f2的线性化载体电转入酵母细胞。
54.在本发明中，所述步骤g中流式细胞仪检测酵母的细胞阳性率包括以下步骤：
55.g1：培养酵母；
56.g2：用磁珠、bta抗原孵化酵母；
57.g3：分别用ha tag antibody ifluor 488、his tag antibody ifluor 647孵化酵母；
58.g4：流式细胞仪检测酵母的细胞阳性率。
59.在本发明中，所述步骤n中的抗体性能测试包括以下步骤：
60.n1：亲和力检测；
61.n2：效价检测。
62.bta抗体序列
63.抗体1
64.轻链
65.dpvmtqtpasvsgpvggtvtincdgsskarngvgkwyqqkpgqppklliygtdnshfgvpsrfsgsgsgtdftltisgvqcddaatyycngeykdaveeldpgggtevvvkgdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc
66.重链
67.qsveesggrlvtpgtpltltctvsplqtgvsamswvrqapgkgleyiglitvtartyyaswakgrftiskts
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74.抗体2
75.轻链
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77.重链
78.qsveesggrlvtpgtpltltctvsngkaedndmswvrqapgkglewigcidiswdtpetyyaswakgrftisktssttvdlkitspttedtaayfcarpevtckvrdvsqwgqgtlvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgc
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83.sisrspgk
84.1、将开发出的1号抗体、2号抗体、3号抗体和主流商品化抗体分别稀释不同的倍数之后，用分子相互作用仪检测抗体的亲和力，测定结果如表1：
[0085][0086]
从表1中的抗体亲和力检测结果来看，可以看出1号、2号抗体比主流商品化抗体试剂盒具有更高的亲和力。
[0087]
2、将开发出的1号抗体、2号抗体、3号抗体和主流商品化抗体分别稀释不同的倍数之后，作用于膀胱肿瘤相关抗原，然后使用酶标仪在450nm处测定并读取od值，测定结果如表2：
[0088][0089]
从表2中的抗体效价检测结果来看，可以看出三种新的抗体与主流商品化抗体试剂盒的检测数据持平或具有更优的结果。
[0090]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，但本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对发明的限制，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何一个或多个
实施例或示例中以合适的方式结合，本领域技术人员在阅读完本说明书后可在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，可以根据需要对实施例做出没有创造性贡献的修改、替换和变型等，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。