技术特征：
1.一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，其特征在于，包括的原料和相应的浓度分别为50-200mm tris缓冲液、50-200mm乙酸钾、5-30mm乙酸镁、5-30mm二硫苏糖醇、5-20wt％聚乙二醇、1-15mm atp、0.2-3mm dntps、20-100mm磷酸肌酸、20-200μg/l肌酸激酶、10-200mg/l海藻糖、1-10wt％甜菜碱、500-1500mg/l t4gp32蛋白、50-300mg/l t4uvsx重组酶、10-100mg/l t4uvsy辅助蛋白、1-5u核酸外切酶、5-100mg/l bsu dna聚合酶，还包括正向引物、反向引物和荧光探针，且每种引物或荧光探针的浓度为150-600nm；所述正向引物、反向引物为未经修饰的正向引物和未经修饰的反向引物，或为氨基化的正向引物和氨基化反向引物，或为巯基化的正向引物和巯基化反向引物。2.根据权利要求1所述的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，其特征在于，包括的原料和相应的浓度分别为50mm tris缓冲液、100mm乙酸钾、15mm乙酸镁、5mm二硫苏糖醇、8wt％聚乙二醇、3mm atp、0.5mm dntps、50mm磷酸肌酸、80μg/l肌酸激酶、150mg/l海藻糖、2wt％甜菜碱、500mg/l t4gp32蛋白、350mg/l t4uvsx重组酶、55mg/l t4uvsy辅助蛋白、90mg/l bsu dna聚合酶、5u核酸外切酶；还包括引物组合，且所述正向引物的浓度为400nm，所述反向引物的浓度为400nm，荧光探针的浓度为120nm。3.根据权利要求1所述的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。4.根据权利要求1所述的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统，其特征在于，所述荧光探针是在如seq id no.3所示的序列上设计四个修饰位点，分别为：在距离5’端的32bp的中部位置标记1个dspacer，在dspacer的上游距离该识别位点1个碱基的位置标记1个荧光基团，在dspacer的下游距离该识别位点1个碱基的位置标记1个淬灭基团，再在3’端末端标记1个封闭基团。5.一种恒温核酸扩增的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统。6.根据权利要求5所述的恒温核酸扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、取nanospr生物芯片进行表面羧基化处理，再用nhs/edc活化表面的羧基；对所述重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中的正向引物和/或反向引物进行氨基化修饰；s2、再将氨基化修饰的引物共价偶联在nanospr生物芯片上；s3、将所述重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中剩余的试剂加至装载有共价偶联了氨基化的引物的nanospr生物芯片的微孔中，进行恒温扩增反应。7.根据权利要求6所述的恒温核酸扩增的方法，其特征在于，步骤s1中，所述nanospr生物芯片的表面羧基化处理和活化表面羧基的具体步骤为：s11、首先在装有nanospr生物芯片的微孔中加入50μl 50mm tcep溶液，反应20min；s12、然后在每个微孔中加入50μl 50mm mpa溶液，4℃过夜，完成nanospr生物芯片表面的羧基化处理；s13、用50mm ph＝4.5的mes溶液将nhs/edc稀释至50mm，在每个微孔中分别加入50μl反应20min，活化nanospr生物芯片的表面的羧基。8.根据权利要求5所述的恒温核酸扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤：p1、对所述重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中的引物合成巯基化正向引物和/或巯基化反向引物，并通过化学方法去除二硫键；
p2、然后将处理后的扩增引物与nanospr生物芯片进行孵育；p3、将所述重组酶介导核酸恒温扩增反应系统中剩余的试剂加至装载有步骤p2制得的nanospr生物芯片的微孔中，进行恒温扩增反应。9.根据权利要求8所述的恒温核酸扩增的方法，其特征在于，步骤p1中，去除正向引物和/或反向引物的二硫键的方法为：取1μmol巯基化的正向引物和/或反向引物，加入4μl 20-200mm tcep溶液反应1-2h。10.一种用于恒温核酸扩增的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4所述的重组酶介导核酸恒温扩增反应系统。
技术总结
本发明公开了一种重组酶介导核酸恒温扩增反应系统及其应用，涉及核酸恒温扩增技术领域，包括的原料分别为Tris缓冲液、乙酸钾、乙酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、肌酸激酶、海藻糖、甜菜碱、T4gp32蛋白、T4UvsX重组酶、T4UvsY辅助蛋白、Bsu DNA聚合酶、核酸外切酶、正向引物、反向引物和荧光探针。本发明还提供了一种恒温核酸扩增的应用，除了常规应用以外，还可将上述反应系统与NanoSPR生物芯片进行联用，能提高灵敏度10-50倍。该方法检测试剂简单，检测步骤少，操作简单，检测速度快，仅需5-20min。20min。20min。
技术研发人员：黄丽萍 陈友倩 何佳俊 刘钢
受保护的技术使用者：量准（武汉）生命科技有限公司
技术研发日：2022.08.25
技术公布日：2022/12/22